51. Молекулярная биология Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.

Ответ. Одной из основных проблем при получении трансгенных растений был способ введения чужеродных генов в хромосомы растений, т. е. трансформация растительных клеток. Значительный прорыв был сделан при открытии возможности использования природной системы трансформации растений Ti-плазмидами почвенных агробактерий. Ранее было известно, что некоторые виды почвенных бактерий (Agrobacleria) могут заражать двудольные растения и вызывать при этом образование специфических опухолей – корончатых галлов. Опухоли состоят из дедифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. При культивировании in vitro клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Помимо повышенного синтеза фитогормонов, опухолевые клетки корончатых галлов начинают синтезировать необычные для растения соединения – опины (производные аминокислоты аргинина), которые используются агробактериями в качестве источника азота и углерода. Агробактерии сами синтезировать опины не могут, так как промежуточные продукты синтеза ингибируют рост бактериальной клетки и используют растительные клетки как «фабрики» по производству опинов. При заражении растения агробактерией происходит перестройка метаболизма трансформированных растительных клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий. Опины не могут утилизироваться растительной клеткой и выделяются в межклетники, где и поглощаются агробактерией. Также ряд бактерий могут содержать агропиновые Ti-плазмиды, кодирующие агропин, также относящийся к опинам. Молекулярно-генетические исследования показали, что все Ti-плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две группы: необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т. д.); необходимые для трансформации растительной клетки. Гены первой группы имеют прокариотический тип промотора, т. е. могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы – могут экспрессироваться в эукариотической растительной клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индукцию опухоли и синтез опиновых аминокислот. Трансформация растения в результате агробактериального заражения происходит в несколько этапов. Сама агробактерия не входит в растительную клетку, она располагается в межклетниках. Не входит в клетку растений и Ti-плазмида, но часть Ti-плазмиды переносится в ядро растительной клетки и может встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент Ti-плазмиды был назван Т-ДНК (трансформирующая ДНК). На концах Т-ДНК находятся прямые высоко консервативные повторы (25 н.п.), составляющие, так называемые, левый и правый пограничные районы, которые необходимы для вырезания ее из состава плазмиды и интеграции в геном растений. Непосредственно границы области Т-ДНК, а также последовательности, примыкающие к этим районам, оказывают влияние на результативность трансформации. При этом, именно последовательность правой границы необходима для интеграции Т-ДНК в геном растения. Деления левой границы не оказывала существенного эффекта на перенос Т-ДНК. Также рядом с правой границей внутри области Т-ДНК располагается специфическая область, влияющая на вирулентность Ti-плазмиды. Деления этой области приводит к тому, что такие Ti-плазмиды не способны индуцировать опухолеобразование.