21. Плазмиды лекарственной устойчивости бактерий.

Ответ. R-плазмиды (от англ. resistance – противодействие, содержат гены – r-гены, ответственные за устойчивость к лекарственным препаратам). Обусловленная R-плазмидами лекарственная устойчивость связана: с изменением проницаемости поверхностных структур бактериальной клетки для антибиотиков; с синтезом ферментов, разрушающих или модифицирующих антибиотики (β-лактамазы, ацетилирование хлорамфеникола). Как правило, R-плазмиды имеют кольцевую форму, но могут принимать и линейную. Их масса и копийность также варьирует. Большие плазмиды, состоящие из более чем 100 тысяч пар оснований, обычно имеются в клетке в количестве 1—2, а более мелкие плазмиды, имеющие размер от 3 до 10 тысяч пар оснований, могут содержаться в числе нескольких экземпляров. В большинстве случаев R-плазмиды находятся в клетке автономно, но иногда они интегрируются в геном. R-плазмиды грамотрицательных бактерий — конъюгативные и содержат tra-оперон, отвечающий за аппарат конъюгации. Опероны, ответственные за резистентность к антибиотикам, обозначают r-оперонами. У грамположительных бактерий R-плазмиды не передаются при конъюгации. R-плазмиды могут передаваться даже между бактериями разных родов и видов: от Salmonella typhimurium к Vibrio cholerae, а от Pseudomonas aeruginosa к Escherichia coli. Некоторые R-плазмиды могут даже мобилизовать конъюгативную передачу нуклеоида одной из клеток-конъюгантов. Плазмида, дающая устойчивость к многим антибиотикам, содержит несколько r-оперонов, каждый из которых обеспечивает резистентность к определённому антибиотику. В r-оперонах часто обнаруживаются транспозоны и интегроны. r-Опероны очень активно экспрессируются и обладают высокой копийностью. Однако на резистентность влияет также вид бактерии-хозяина: например, Shigella во много раз устойчивей к стрептомицину, чем E. coli. Некоторые R-плазмиды неспособны к сосуществованию в одной клетке, из-за чего их разделяют на 4 группы несовместимости. Гены устойчивости часто находятся в мобильных элементах (транспозонах и интегронах). R-плазмиды могут постепенно встраивать интегроны с разными генами совместимости. Как правило, R-плазмиды имеются у патогенных бактерий, однако иногда их резервуарами могут быть и непатогенные бактерии, например, молочнокислые, которые служат промежуточным звеном в передаче R-плазмид между разными видами бактерий. Механизмы лекарственной устойчивости различны. Бактериальная клетка может менять проницаемость своей клеточной стенки, активно выводить молекулы антибиотика из себя, ферментативно модифицировать или разрушать его, изменять его мишень, обзаводиться новыми метаболическими путями, которые ингибируют антибиотик. Первым успешным вектором, который начали использовать в генной инженерии, стала кольцевая плазмида pSC101. Размер плазмиды pSC101 – 9,1 т.п.н. Находится под строгим контролем репликации, детерминирует устойчивость к тетрациклину и обладает единственным местом действия рестриктазы EcoRI, которое расположено в несущественной для репликации области и не затрагивает ген устойчивости к тетрациклину (tet). Кроме того, на ДНК pSC101 в гене tet имеется по одному участку узнавания рестриктаз HindIII, BamHI и SalI. Плазмида pSC101 как клонирующий вектор имеет ряд недостатков: при встройке фрагментов ДНК по EcoRI-месту обычно не удается фенотипически отличить клоны трансформантов бактериальных клеток, содержащих исходную или гибридные плазмиды; при встройке по местам действия рестриктаз HindIII, BamHI и SalI нарушается ген tet, и клоны, содержащие гибридные плазмиды, будут иметь фенотип Tcs, как и исходные клетки, и поэтому обычными методами их выявить нельзя; pSC101 имеет строгий контроль репликации и находится в клетке в количестве примерно шесть копий на бактериальную хромосому. Однако было установлено, что не все гены можно копировать в многокопийных векторах. Это связано с тем, что повышенная доза клонированного гена вызывает суперсинтез белка, а высокая концентрация некоторых регуляторных или структурных белков приводит к гибели клетки. Поэтому для клонирования таких генов подходят низкокопийные векторы. Подходящими низкокопийными векторами как раз являются векторы, производные от pSC101.