30. Свойства бактериофага лямбда как универсальной системы для клонирования in vivo и in vitro.

Ответ. Векторы на основе фага λ появились в 1974 г.. ДНК фага λ двухцепочечная, линейная, размер 48 502 пн. На концах имеются одноцепочечные ГЦ- концы длиной 12 н. Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего двухцепочечную линейную молекулу ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла (репликации, размножения). Средняя часть генома бактериофага λ (содержит гены, контролирующие лизогению, т.е. его интеграцию в ДНК бактериальной клетки) не существенна для его размножения и составляет примерно 25 тыс.п.н. Данная часть может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Такие модифицированные фагипроходят литический цикл, но лизогения не происходит. Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК. Жизненные циклы большинства фагов в основном схожи. Однако у одних из них жизненный цикл протекает без перерывов; в таком случае говорят о литическом цикле развития. У других фагов, таких как фаг лямбда, фаговая ДНК, оказавшись в клетке, встраивается в ДНК клетки-хозяина и никак не проявляется на протяжении многих поколений. При каждом делении клетки фаговая ДНК копируется вместе с клеточной ДНК. Такой неактивный фаг называют профагом. Но в какой-то момент профаг вновь активируется: высвобождается из клеточной ДНК и завершает свой жизненный цикл, вызывая гибель клетки-хозяина обычным путем. Такие фаги называют лизогенизирующими, а клетку с встроенным в нее профагом – лизогенной. На основе ДНК бактериофагов сконструированы несколько типов молекулярных векторов. Векторы внедрения имеют в своем составе один сайт встраивания фрагмента чужеродной ДНК. Векторы замещения имеют два или более мест встраивания экзогенных фрагментов ДНК за счет замещения фрагментов векторной фаговой ДНК. Космиды – это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага λ (cos-сайт), обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу in vitro. Фазмиды – это молекулярные векторы, которые являются искусственными гибридами между фагом и плазмидой. В их составе обнаруживаются фрагменты ДНК бактериофага λ, содержащие все гены, необходимые для литической инфекции, а также плазмидная ДНК. Гены репликации как фага, так и плазмиды в фазмидах сохранены. Перед инфекцией клеток бактерий фазмидные ДНК упаковываются in vitro в капсидные белки фага λ. Попадая в клетки, фазмида реплицируется с использованием областей фага λ, в результате чего на газоне чувствительных бактерий образуются негативные колонии. Если же присутствует ген, кодирущий синтез репрессора фага λ, то фазмида реплицируется как плазмида. Кроме того, если ген-репрессор кодирует дефектный белок сI, инактивирующийся при повышенной температуре (температуро-чувствительный репрессор), то фазмида реплицируется как плазмида при низкой температуре или как бактериофаг при повышенной. В середине молекулы ДНК фага λ (длиной около 50 тпн) расположен участок хромосомы (около 20 тпн), который не является необходимым для литического развития бактериофага. Его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осуществить клонирование фрагментов путем размножения рекомбинантного бактериофага. Использование векторов на основе фага λ для клонирования фрагментов ДНК в клетках Ε. Сoli. Чтобы получить лизаты (т.е. суспензии с фагами) бактерии, несущие лизогенные фаги, обрабатывают ультрафиолетом, митомицином С или повышенной температурой. Хранят лизаты фагов над хлороформом, который убивает все неинфицированные и неиндуцируемые клетки донора. Для упаковки молекул ДНК в фаговую частицу in vitro смешивают в пробирке бесклеточные экстракты двух штаммов E. coli. В одном штамме содержится мутация, приводящая к инактивации одного из белков фагового капсида, а в другом штамме – мутация, препятствующая включению фаговой ДНК в головку бактериофага. Таким образом, хотя экстракт каждого по отдельности штамма содержит пустые головки, фаговую ДНК и отростки, полноценный фаг в этих экстрактах не образуется. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов E. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций и сборке полноценных фаговых частиц. При этом образуется 10⁴–10⁵ фаговых частиц на 1 мг упаковываемой ДНК.