18. Сегрегационная и структурная нестабильность плазмид.

Ответ. В связи с применением молекулярных векторов на практике, важно знать, насколько стабильны они в бактериальных клетках при многочисленных пересевах штамма. Бактериальные внехромосомные молекулы ДНК характеризуются определенной степенью нестабильности, т.е. они не могут наследоваться бесконечно при делении клетки и не могут бесконечно сохранять свою генетическую структуру в неизменном виде. Наиболее хорошо у прокариот изучена проблема нестабильности плазмид у E. coli. Существует 2 типа нестабильности плазмид in vivo: сегрегационная – утрата в процессе деления клеток, и структурная – изменение структуры. Структурная нестабильность заключается в том, что плазмиды подвергаются спонтанным генетическим изменениям: точечным заменам нуклеотидов, делециям, дупликациям, инверсиям, встройке элементов типа IS (insertion sequence) и Tn (транспозонов). Обычно всякого рода мутации не дают плазмиде селективных преимуществ в размножении. Поэтому по преимуществу плазмиды без мутаций сохраняются в растущей бактериальной культуре. Если же дают преимущества, то исходная плазмида будет постепенно вытесняться в культуре мутантной формой. Если наличие плазмиды снижает жизнеспособность, популяция будет постепенно обогащаться безплазмидными клетками. Обычно различия в скорости размножения клеток с и без плазмиды проявляются при дефиците какого-либо фактора среды, необходимого для роста (и дефицит которого компенсируется генотипом плазмиды). Стабильность плазмиды определяется в основном ее генотипом. Было обнаружено, что существуют специальные молекулярные механизмы распределения плазмид при делении клетки, при этом стабильность наследования не зависит от копийности плазмиды. Генетический локус (набор генов), ответственный за равномерное распределение плазмид при делении, был назван par (partition). Например, в плазмиде pSC101 локус par находится возле локуса ori. Введение локуса par из pSC101 в менее стабильные плазмиды приводит к повышению их стабильности. В F-плазмидах локус par включает несколько генов, кодирующих белки, участвующие в процессе разделения плазмид. Размер такого полного локуса par – 2.8 т.п.н. Один из его элементов служит для связывания плазмидных белков разделения и некоторых белков клетки-хозяина, и такой ДНК-белковый комплекс называется партисомой. Как показали эксперименты по сохранности плазмид в клетках E. coli, при длительных пересевах число плазмидсодержащих клетов убывает в виде плавной кривой, и после 300–350 клеточных делений клетки теряют плазмиды вовсе. Причем индивидуальные клоны E. coli различаются по темпам утраты плазмид. Плазмиды с большей копийностью поддерживаются «с большим успехом», т.е. начинают исчезать из части клеток после 200 делений. Генно-инженерные элементы, снижающие стабильность плазмидных векторов: наличие сильного промотора (интенсивная траскрипция может подавлять репликацию и снижать копийность плазмиды); экспрессирующие векторные плазмиды, вызывающие сверхсинтез белка, часто приводят к утрате плазмиды или мутациям в ней; наличие протяженных тандемных повторов в составе гибридной плазмиды ведет к ее структурной нестабильности (делеции таких повторов). Стабильность структуры плазмиды и ее поддержание в культуре бактериальных клеток, по-видимому, во многом зависит от окружающих условий. Известно, что при росте на богатых питательных средах плазмидосодержащие и бесплазмидные клетки обычно делятся с одинаковой скоростью. В условиях же лимитирования по какому-либо фактору роста у плазмидосодержащих клеток время генерации, как правило, больше, чем у изогенного бесплазмидного штамма. Вероятно, это обусловлено тем, что плазмида вносит определенные изменения в метаболизм бактериальной клетки, что приводит к появлению дополнительных пищевых потребностей у плазмидосодержащих штаммов. В некоторых случаях при лимитировании размножения культуры по какому-либо фактору роста могут селективно отбираться такие варианты плазмид, в которых нарушены лишь определенные генетические детерминанты. Многие векторные плазмиды Е. coli получены на основе плазмид типа ColEl, из которых наиболее популярны плазмиды группы pBR и их многочисленные производные. Поэтому стабильность поддержания в Е. coli как данных векторов, так и гибридных молекул ДНК, созданных на их основе, изучена довольно подробно. Для того чтобы выявить возможные изменения структуры плазмиды в высокостабильном клоне, ее выделили из клеток и провели рестрикционный анализ с помощью мелкощепящей рестриктазы BspRl. Различий в рестрикционных картинах выделенных плазмидных ДНК и исходной pBR327 не обнаружено. При трансформации клеток Е. coli CSH54 плазмидной ДНК из стабильных клонов наблюдали обычную гетерогенность трансформантов по признаку стабильности поддержания плазмиды pBR327. Это косвенно подтверждает, что высокая стабильность некоторых вариантов CSH54[pBR327] обусловлена генотипом клеток. Ряд генов Е. coli, влияющих на стабильность поддержания плазмидных молекул, уже выявлен. Так, для репликации плазмид ColEl – типа необходимы различные факторы клетки-хозяина, в частности ДНК-полимераза I и РНК-полимераза. Мутанты Е. coli, дефектные по ДНК-гиразе, эндонуклеазам I, III и V, характеризуются повышенной частотой утраты плазмид типа ColEl. Тем не менее о взаимоотношениях плазмиды с клеткой-хозяином известно еще очень мало. Например, найдены штаммы Е. coli, обеспечивающие стабильное поддержание гибридных плазмид, однако генетическая основа этого явления пока не установлена. Дальнейшие исследования позволят более целенаправленно формировать генотип штамма-реципиента, для того чтобы стабилизировать наследование вводимых в него плазмид. При конструировании in vitro гибридных молекул ДНК и последующем введении их в клетки Е. coli возникают дополнительные проблемы как со стабильностью наследования этих молекул, так и с устойчивостью их структуры. В частности, встроенный в плазмиду сильный гетерологичный промотор может нарушить поддержание гибридных молекул ДНК в бактерии. Такой эффект обусловлен тем, что интенсивная транскрипция с клонированного промотора подавляет репликацию плазмиды и, следовательно, приводит к снижению ее копийности. Стабилизировать такие гибридные плазмиды удается, если встроить в них терминатор транскрипции в 3'-положении от сильного промотора. Встройка в многокопийные векторные плазмиды отдельных генов или целых оперонов часто вызывает сверхсинтез их продуктов за счет повышенной дозы гена. В ряде случаев это отрицательно влияет на физиологию бактериальной клетки, что может приводить в процессе роста культуры к утрате гибридной плазмиды или перестройкам в ее структуре (делеции, интеграция IS-элементов и т. п.), которые уменьшают или подавляют экспрессию клонированных генов. Для поддержания штамма с плазмидой прибегают к методам автоселекции. Автоселекция плазмидсодержащих клеток – это культивирование их в таких условиях, когда клетки, теряющие плазмиду, лишены возможности размножаться. Например, по методу Мива и соавторов (1984) возможен отбор клеток на средах без антибиотиков: в качестве бактерии-хозяина использован штамм E. coli со стрептомицинзависимым фенотипом (Smd). Целью эксперимента было маскировать этот фенотип (сделать его стрептомициннезависимым – Smi) с помощью плазмидного вектора. Для этого в состав вектора pBR322 встраивали хромосомную ДНК штамма E. coli, не имеющего фенотипа Smd. Вектором трансформировали E. coli Smd, и отбирали клоны с фенотипом AprSmi. В результате был выделен ген rpsL, определяющей стрептомициннезависимый фенотип. Встройка этого гена в любой плазмидный вектор обеспечивает ее стабильное поддержание в штамме E. coli Smd на среде без стрептомицина. Бесплазмидные клетки на такой среде не растут, а жизнеспособны только клетки, несущие гибридные плазмиды с геном rpsL. Недостатком предложенной системы автоселекции является то, что для нее нельзя использовать подходы, связанные с термоиндукцией репликации гибридной плазмиды или транскрипции целевого гена. На стабильность поддержания гибридных ДНК in vivo большое влияние оказывает их макроструктура (суперспирализация, мультимеризация и др.). В частности, встройка чужеродных фрагментов ДНК иногда значительно изменяет макроструктуру (топологию) плазмиды, что отрицательно сказывается на ее репликации и стабильности наследования. Однако в результате спонтанно возникающих in vivo делеций могут образовываться и устойчиво наследуемые варианты гибридных плазмид. Необходимо отметить, что встройка в плазмиды чужеродных фрагментов ДНК не всегда отражается на стабильности поддержания плазмид в Е. coli. В ряде случаев чужеродные фрагменты ДНК, в несколько раз превосходящие по размеру векторную плазмиду, могут стабильно сохраняться в гибридной молекуле. Известно, что в молекулах ДНК фагов, плазмид, бактериальных хромосом имеются короткие инвертированные повторы длиной 9–13 пн. Такие палиндромные структуры могут стабилизировать суперкольцевую форму ДНК, а также представлять собой участки взаимодействия ДНК с белками клетки. Более протяженные инвертированные повторы в ДНК плазмид и фагов могут значительно изменять топологию этих молекул in vivo, нарушая механизм регуляции транскрипции и репликации. Протяженные инвертированные повторы, как правило, или выщепляются из гибридных молекул ДНК с высокой частотой, или обусловливают летальность конструируемых in vitro молекул. Состыкованные инвертированные повторы длиной 100–150 пн могут сохраняться в составе плазмид, реплицирующихся в клетках Е. coli дикого типа. При встройке прилежащих друг к другу инвертированных повторов большей длины плазмиды, как правило, не способны реплицироваться в клетках дикого типа, но реплицируются во множественных мутантах по системе рекомбинации типа Е. coli recBrecCsbcBrecF. Однако и в последнем случае наблюдаются делеции в.районе встроенного палиндрома. Введение достаточно протяженной последовательности между инвертированными повторами позволяет заметно стабилизировать наследование клетками плазмид. Прямые (тандемные) повторы средней длины, по-видимому, более устойчиво сохраняются в структуре гибридных молекул ДНК, чем инвертированные. В то же время протяженные тандемные повторы в составе гибридных ДНК характеризуются высокой степенью нестабильности. Выщепление повторяющихся последовательностей происходит в результате внутри­молекулярной или межмолекулярной рекомбинации гибридной ДНК и зависит, хотя и не полностью, от системы рекомбинации бактериальной клетки. Таким образом, при клонировании чужеродных фрагментов ДНК в составе внехромосомных векторов Е. coli нужно учитывать целый спектр параметров, влияющих на стабильность гибридных молекул в бактериальной клетке.