52. Структура т-днк. Использование Ti-плазмиды в качестве векторов для создания трансгенных растений.

Ответ. В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов. Ген iaaM1 кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая переводит триптофан в индолилацетамид. Ген iaaH2 кодирует гидролазу, превращающую индолилацетамид в гормон растений ауксин – индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Совместная деятельность продуктов генов 1 и 2 обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения. Изопентенилтрансфераза, кодируемая геном ipt, катализирует ранние стадии биосинтеза природного цитокинина. Гены iaaM, iaaH и ipt представляют собой онкогены, так как продуктами этих генов являются фитогормоны ауксин и цитокинин, которые индуцируют деление клеток. Ген 5 отвечает за синтез индол-3-лактата, который является продуктом превращения ауксина. Этот метаболит проявляет антиауксиновый эффект. Ген tml6 влияет на величину опухоли; транскрипт 6а необходим для секреции нопалина и октопина, а ген 6б изменяет чувствительность растительных тканей к цитокинину и сохраняет клетки в недифференцированном состоянии. Итак, четыре или, возможно, пять генов подавляют дифференцировку опухолевых клеток и переводят их в состояние деления, а еще один ген кодирует фермент, катализирующий синтез опинов. Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК. Размеры и формы молекул выбраны произвольно. Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения (например, ацетосирингон), углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии, чувствует присутствие ацетосирингона и изменяет способность VirA отвечать на фенольные соединения. VirA является гистидиновой протеинкиназой, способной к аутофосфорилированию, он дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной клетки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG. Фосфорилированный VirG активирует транскрипцию остальных vir-генов. Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин – больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется. Оперон VirD кодирует несколько продуктов. Один из них является двухкомпонентной эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы, режущей точно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар оснований повтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение. Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин. Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. Недавние результаты анализа нуклеотидных последовательностей в участках растительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК, показали, что есть гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от места встраивания и наружными областями плазмидной ДНК агробактерий. В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транскрипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины – источник азота и углерода. Ti-плазмиды крупные, различаются от 200 и более тыс. пар оснований, и выделением в ее составе 4 функциональных групп генов. Tra – гены отвечающие за передачу Ti-плазмиды между клетками. Rep – гены связанные с репликацией. Vir – отдельно; гены вирулентности – их продукты отвечают за образование опухоли, т. е. они стимулируют синтез ИУК (индолилуксусная кислота). Около 10% тела Ti-плазмиды – Т-ДНК – этот фрагмент способен передаваться растительной клетке и случайным образом встраиваться в одну из хромосом. Важным для вырезывания Ti-плазмид является наличие на концах Т-ДНК коротких последовательностей размером 25 пар оснований. За счет активности продуктов vir генов в пределах этих последовательностей происходит вырезание Т-ДНК и перенос ее в растительную клетку. Исходя из этого, были сконструированы 2 типа векторов используемые для клонирования в растительных клетках. Уникальные биологические свойства Ti-плазмиды делают ее идеальным природным вектором для переноса генов. Ti-Плазмида имеет широкий круг хозяев, встраивает Т-ДНК в хромосомы растений, где она может реплицироваться, и ее гены транслируются с образованием белка. Существенно также, что границы Т-ДНК обозначены прямыми повторяющимися последовательностями длиной 25 нуклеотидных пар, и любой фрагмент чужеродной ДНК, вставленный между этими повторами, будет перенесен в растительную клетку. Однако манипуляции с Ti-плазмидой затруднены из-за больших размеров, вставить ген в плазмиду традиционными методами не представляется возможным. Поэтому Ti-плазмида была модифицирована генно-инженерными путями, и на ее основе были получены векторы для трансформации растений. Кроме того, надо отмстить, что после трансформации растений природной Ti-плазмидой трансформированные клетки не будут способны к регенерации, поскольку в них подавлена дифференцировка за счет активности шести генов Т-ДНК области, кодирующих признаки опухолеобразования. Если же последовательности генов, блокирующих дифференцировку, вырезать из Т-ДНК, трансформированные клетки обретут способность к регенерации. Поэтому при использовании Ti-плазмид для получения векторных конструкций последовательности генов, ответственных за опухолеобразование и синтез опинов, вырезают, оставляя только фрагменты Т-ДНК, необходимые для ее переноса в растительный геном (прежде всего последовательности левого и правого пограничного повторов). В область Т-ДНК в дальнейшем и встраиваются чужеродные гены, которые желательно ввести в геном растения. Таким образом, векторы для трансформации растений на основе Ti-плазмид агробактерий должны содержать следующие структурные элементы: последовательности правой и левой границы Т-ДНК, а также последовательности, необходимые для переноса и встраивания области Т-ДНК в геном растительной клетки; последовательность гена селективного маркера, что позволит проводить селективный отбор трансгенных растений. В качестве селективного маркера могут использоваться гены устойчивости к антибиотикам (nptll –устойчивость к канамицину, hptll – устойчивость к антибиотику гигромицину), ген tor (устойчивость к гербициду фосфинотрицину (BASTA) и ген ALS (устойчивость к гербициду хлор-сульфорону), ген бета-глюкуронидазы (фермент расщепляющий субстрат X-Gluc) и ряд других; последовательности, облегчающие встраивание целевого гена (полилинкерные последовательности, промоторные и терминаторные последовательности); сайты инициации для репликации в бактериальных клетках. Один из способов, облегчающий введение чужеродной ДНК в геном растения, заключается в использовании коинтегративных векторов. Смысл подхода состоит в следующем. Весь процесс введения чужеродного гена в геном растений делится на два этапа: клонирование гена, который следует встроить в растительный геном, и собственно трансформация растительной клетки. Эти два этапа осуществляются с помощью различных векторов. В качестве вспомогательного (промежуточного) вектора, в котором проводят клонирование нужного нам гена, используют векторы на основе плазмиды Е. coli, в которые вставляют фрагмент Т-ДНК с пограничными последовательностями Т-ДНК и ген селективного маркера (обычно ген, кодирующий устойчивость к антибиотику (канамицину, гигромицину или гербициду), что в будущем позволит проводить селективный отбор трансгенных растений. Такой вектор обладает небольшими размерами, и его используют для клонирования в нем нужного гена, вставляя его последовательность в область Т-ДНК. С помощью конъюгации такой промежуточный вектор переносят в клетки специальных штаммов A. lumefaciens, содержащих другой вектор, несущий гены, необходимые для интеграции области Т-ДНК в геном растения. Этот вектор имеет значительные размеры и представляет собой фрагмент Ti-плазмиды, несущей v/r-область, пограничные последовательности Т-ДНК и фрагменты плазмиды, аналогичные промежуточному вектору. После конъюгации происходит рекомбинация между гомологичными участками двух векторов, в результате фрагмент промежуточного вектора, содержащий нужный ген и селективный маркер, переносятся во второй вектор с v/r-областью и пограничными последовательностями Т-ДНК. Таким образом, в результате рекомбинации между двумя плазмидами получается коинтегративный вектор. Клетки агробактерий, содержащие такой коинтегративный вектор, отбираются на селективных средах и используются в дальнейшем для трансформации растений.