7. Рестрикционные нуклеазы и их характеристика.

Ответ. Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) – это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции). Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся «чужеродной» именно по типу ее модификации. За «метку» отвечают метилирующие ферменты модификации, так называемые ДНК-метилазы. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрицирующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах. Поскольку разные бактерии по-разному метят свою ДНК, то и рестриктазы должны узнавать разные последовательности. Выделены рестриктазы, узнающие более 150 сайтов рестрикции (мест расщепления ДНК). Каждая рестриктаза узнает только свой сайт рестрикции. Эти ферменты работают на ДНК всех организмов. Главное условие – наличие на ДНК распознаваемых участках. Обычно рестриктазы распознают короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки ДНК длиной в 4–6 п.н. и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков (образуются «тупые» концы ДНК) или с некоторым смещением (образуются «липкие» концы ДНК). Для осуществления эндонуклеазной активности рестриктазам требуется кофактор в виде Mg2+, S-анедозил-L-метионин (Адо-мет) или АТФ. Расположившись на месте разрыва, эти молекулы или ион вмешиваются в конфигурацию ДНК, что способствует последующему расщеплению. Номенклатура рестриктаз (X. Смит, Д. Натане, 1973 г.). Название фермента – это производное от бинарного родо-видового обозначения микроорганизма-хозяина, содержащего данную R-M систему. Правило составления: к первой прописной букве названия рода добавляется две первые строчные буквы вида. Пример: Escherichia coli – Eco. За родовидовым названием, обозначаемым курсивом тремя буквами, (при необходимости), обозначается серотип или штамм: Escherichia coli В – EcoB. Последовательность открытия рестриктаз в клетках одного вида обозначается римскими цифрами: HindI, HindII, Hindlll. Ферменты рестрикции-модификации в общем виде обозначаются как эндонуклеаза R или метилаза М с последующим определением названия системы: эндонуклеаза R • HindII или метилаза М • HindII. Если система генетически локализована в геноме фага или на плазмиде, то после родовидового названия указывается символ внехромосомного элемента: EcoPl. Штаммо вая принадлежность в этих случаях указывается в скобках: Есо(К)РI. При совпадении названия для нескольких ферментов, остаются неизменными первые две буквы, а третья берется из последующих букв видового названия: Haemophilusparainfluenzae – Hpаl, Haemophilus parahaemolyticus – Hphl. В основе классификации рестриктаз главная роль отводится потребности фермента в кофакторах и характеру расщепления ДНК. Рестриктазы класса I. Наиболее изучены ферменты ЕсоК и ЕсоВ. Они выделены из клеток Е. coli К12 и Е. coli В и при этом схожи по структуре. Оба фермента содержат три типа неидентичных субъединиц с молекулярной массой 135,60 и 50 кДа, но отличаются по соотношению субъединиц. Свойства: требуют в качестве кофакторов аденозинтрифосфат (АТР), S-аденозинмонофосфат (SAM), ионы Mg2+; расщепление ДНК совмещено с гидролизом АТР; в едином субъединичном белке имеются следующие ферментативные активности: расщепление ДНК (α-субъединица); метилирование ДНК (β-субъединица) и узнавание специфической последовательности ДНК (γ-субъединица). Ферменты ЕсоВ и ЕсоК узнают строго специфичные последовательности. При этом разрыв ДНК происходит случайным образом на значительном расстоянии от участка узнавания – 400–7000 пн. Продукты расщепления ДНК гетерогенны. Особенности работы. Фермент после взаимодействия с ДНК в сайте рестрикции инициирует АТР-зависимую транслокацию (перемещение) цепей ДНК через себя в обоих направлениях. При встрече двух соседних молекул фермента, транслоцирующих ДНК, они разрезают двухцепочечную ДНК в районе контакта. Причина гетерогенности продуктов – неодновременное случайное взаимодействие молекул фермента с разными участками узнавания на каждой молекуле ДНК и, соответственно, неодновременное начало транслокации цепей ДНК. Системы рестрикции-модификации класса II представлены отдельными белками рестрикционной эндонуклеазы и модификационной метилазы. Поэтому эти рестриктазы можно выделить в индивидуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что в значительной мере упрощает их изучение и последующее использование для расщепления молекул ДНК.Рестриктазы класса II состоят из белков с относительно простой организацией – представлены двумя субъединицами одного типа с небольшой молекулярной массой. Особенности: узнают и разрезают немодифицированную двухцепочечную молекулу ДНК по специфичным нуклеотидным последовательностям. В результате образуется дискретный набор фрагментов анализируемой ДНК; для специфического действия требуются лишь ионы Mg2+ в физиологических концентрациях; как правило, узнают последовательности длиной 4-8 пн, имеющие ось второго порядка, – палиндромы. Некоторые рестриктазы, например, AluI расщепляют ДНК строго по оси симметрии узнаваемой последовательности, что приводит к образованию фрагментов ДНК с тупыми концами. Фермент EcoRI узнает гексануклеотидную последовательность и разрезает ее с образованием взаимокомплементарных одноцепочечных липких концов.Если гидролизовать молекулы ДНК различного происхождения рестриктазой ЕcoRI, то в каждом случае будет образовываться строго определенный специфический набор фрагментов ДНК с идентичными липкими концами. При смешивании разных препаратов таких фрагментов ДНК в определенных условиях липкие концы могут слипаться за счет комплементарных взаимодействий, и таким образом могут стыковаться фрагменты молекул ДНК, выделенных из любых организмов. Данные свойства стали причиной частого использования рестриктаз класса II в ГИ. Кроме выступающих 5'-концов рестриктазы могут образовывать также липкие 3'-концы. Пример: рестриктаза PstI. Ряд рестриктаз узнают частично вырожденные последовательности, поэтому они лишены высокой специфичности. Например, Hindll узнает и расщепляет последовательности с общей формулой GTPy↓PuAC. Размер узнаваемой рестриктазой последовательности, как правило, обусловливает частоту встречаемости этих участков в природных ДНК. Для случайной последовательности ДНК бесконечной длины с равным содержанием каждого из четырех нуклеотидов вероятность наличия определенной последовательности длиной N (РN) на молекуле ДНК будет равна 4-N, причем вырожденность последовательности участков узнавания, обнаруженная для некоторых рестриктаз, увеличивает данную вероятность. Средняя частота встречаемости: тетрануклеотида – Р4 = 4-4= 3,9 х 10^-3; октануклеотида – Р8 = 1,2 х 10^-5. Рестриктазы, узнающие последовательность из четырех пн, часто называют мелкощепящими, рестриктазы с участком узнавания в шесть и более пн – крупнощепящими. Если обнаруженная рестриктаза распознает новую последовательность, она называется прототипом. В настоящее время выделено более 500 рестриктаз класса 2, однако среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию, когда ферменты узнают одну и ту же последовательность нуклеотидов и разрывают ДНК в одних и тех же точках, и ложную – гетерошизомеры, когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, – через 4096 пар оснований. Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК-рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящими рестриктазами и незначительна при применении крупнощепящих эндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами, либо применяют прием "недорестрикции", т.е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте. Рестриктазы класса III. В какой-то степени схожи с рестриктазами класса I. Нативный фермент содержит две различные субъединицы. Он бифункционален проявляет как рестриктазную, так и метилазную активность. Рестриктазы класса III узнают несимметричные последовательности длиной 5-6 пн и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24–27 пн, образуя одноцепочечные 5'-концы длиной 2–3 нуклеотида. Для проявления эндонуклеазной активности требуются только АТР и ионы Mg2+, a SAM лишь стимулирует реакцию. Расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТР. Эти ферменты in vitro не обеспечивают нужного гидролиза ДНК. Причины этого пока неизвестны.