48. Организация генома вируса sv40. Векторы на основе вируса sv40.

Ответ. Вирус SV40 – вид полиомавирусов, обнаруженный в клетках обезьян, из рода Betapolyomavirus, является типовым видом рода. Как и у других полиомавирусов, геном SV40 представлен кольцевой двуцепочечной ДНК. Двунитевая кольцевая ДНК вируса содержит 5243 п.н. Отсчет нуклеотидов ведут по часовой стрелке от единственного BglI-сайта, расположенного в точке начала репликации. Слева от него находится ранний ген А, кодирующий два белка (T- и t-антигены). Эти белки необходимы для репликации вируса. Вирион прикрепляется к рецепторам MHC класса 1 на поверхности клетки при помощи гликопротеина VP1. Внутри ядра клетки клеточная РНК-полимераза II экспрессирует ранние гены. Транскрибированная мРНК подвергается разрезанию на два фрагмента, кодирующие большой и малый Т-антигены. Около 5% большого Т-антигена поступает в плазматическую мембрану клетки, а около 95% поступает в ядро. В большой Тантиген связывается с тремя сайтами в вирусной ДНК, связывание с сайтом I и II регулирует синтез ранних РНК, связывание со вторым сайтом происходит в каждом клеточном цикле II. Связывание с сайтом I вызывает репликацию ДНК в месте ориджина репликации. Сборка вирионов осуществляется в ядре клетки. Справа от ori-сайта расположены три перекрывающихся поздних гена, содержащую информацию о синтезе структурных белков VP1, VP2 и VP3. Ранние и поздние гены транскрибируются с одного двунаправленного промотора, локализованного рядом с точкой начала репликации. Он включает в себя два тандемных повтора размером 72 п.н., являющимися энхансером для ранних и поздних генов вируса. Ранний первичный транскрипт подвергается альтернативному сплайсингу, приводящий к образованию мРНК антигенов. Поздний первичный транскрипт также подвергается альтернативному сплайсингу, образуя мРНК трех типов, образующих белки вирусного капсида. SV 40 – обезьяний вирус может с различным результатом размещаться в клетках макак резус и в клетках грызунов. При заражении обезьян данный вирус проходит литический цикл развития, т. е., после проникновения в цитоплазму клетки, происходит раздваивание вируса. ДНК попадает в ядро клетки, где начинается транскрипция ранних, а затем и поздних генов. Ранние гены обеспечивают образование вирусных НК и обозначаются как T, t-антиген. Поздние гены – обеспечивают образование 3 белков вирусного капсида VP 1, VP 2, VP 3. В результате происходит образование зрелых вирусных частиц, ч/з 30 мин – лизис инфицированной клетки. Клетки, в которых происходит литический цикл развития – клетки пермиссивные. Если SV 40 попадает в организм грызуна, он встраивается в одну из хромосом и развивается. Наблюдается неупластическая трансформация – непермиссивные. Необходимо наличие точки начала репликации, наличие регуляторной последовательности, для начала транскрипции и-РНК. Суммарные размеры рекомбинантной ДНК не должны быть более 5 тыс. пар оснований. Либо в составе рекомбинантной ДНК, либо в составе генома клетки д. б. гены, которые обеспечивают образование белков малого и большого антигена, а также белков вирусного капсида. В настоящее время существует 3 вектора на основе SV 40. Векторы трансдуцирующие – рекомбинантные ДНК вводятся в пермиссивные клетки, которые образуют вирусные частицы. Векторы плазмидные – рекомбинантные ДНК вводятся в непермиссивные клетки, в которые она за определенное время либо встраивается, либо наследуется как плазмида. Векторы пассивные (трансформирующие векторы) – служат для введения ДНК в клетки, обеспечивая ее встраивание в хромосому, но сам вектор в клетке не наследуется. С учетом этих подходов можно использовать 2 приема для введения рекомбинационной ДНК в клетку. В составе вирусной ДНК на чужеродном фрагменте можно заменить либо ранние области генома, либо поздние. В случае, если идет замещение поздней области генома, необходимо использовать вирусы-помощники, прошедшие посттрасвекции или заражение 2 типовыми вирусными частицами, которые различаются дефектам в ранней или поздней области гена. Образуется потомство с частицами без рекомбинантных ДНК и с частицами вируса-помощника. Замещение ранней области генома – используются специальные клеточные линии (cos линии клеток) в которой содержатся гены связанные с образованием малого и большого Т-антигена и при попадании в такие клетки рекомбинантных ДНК инициируется репликация такой ДНК, синтезируются белки вирусной оболочки и образуются вирусные частицы, все из которых содержат рекомбинационные ДНК. Из-за насыщенности генетической структуры вируса SV40 лишь в ограниченном числе мест на его ДНК могут происходить незначительные перестройки типа вставок или делеций без потери жизнеспособности вируса. При встройке в ДНК данного вируса чужеродного фрагмента по любому из уникальных мест гидролиза рестриктазами будет происходить нарушение той или иной функции, т. е. гибридные вирусы SV40 будут дефектны. Чтобы гибридная ДНК могла упаковаться в вирусный капсид, ее размер должен составлять 70–100% генома вируса. Поэтому для получения гибридного вирусного потомства необходимо чужеродный фрагмент ДНК встраивать в молекулу вирусной ДНК, у которой предварительно с помощью рестриктаз делетирован определенный район. Такие векторы являются векторами замещения. Обязательное условие при конструировании гибридных вирусов – сохранение неповрежденной области начала репликации вирусной ДНК. Нарушенные при встройке в векторную ДНК другие вирусные функции необходимо комплементировать с помощью вирусапомощника. Молекулярные векторы данного типа на основе ДНК вируса SV40 называют литическими векторами. В большей части выполненных исследований гибридные вирусы SV40 получены замещением участка ДНК из области поздних генов вируса фрагментом чужеродной ДНК. Гибриды данного типа содержат полностью область ранних генов и репликатор вируса SV40 и могут размножаться в виде вирусных частиц при совместной инфекции пермиссивных клеток с вирусомпомощником дикого типа или термочувствительным мутантом по ранним генам (обычно tsA). Для встройки фрагментов ДНК в область поздних генов вируса SV40 можно использовать рестриктазы НраII, ЕсоШ, ВатШ и др., имеющие уникальные места гидролиза на вирусной ДНК, а также Hhal, имеющую два участка гидролиза. При использовании других рестриктаз обычно проводят неполный гидролиз вирусной ДНК, продукты гидролиза разделяют электрофорезом и векторный фрагмент ДНК SV40 выделяют из геля. Векторы с замещением поздних генов вируса. Вектор SVGT1 был получен путем удаления из вирусной ДНК поздних генов с помощью единственных сайтов HpaII и BamHI. В него был встроен подходящий по размеру фрагмент ДНК фага λ. Образовавшаяся рекДНК была введена в клетки трансфекцией совмествно с ДНК вируса-помощника SV40tsA, имеющего термочувствитеьную мутацию в гене репликации А. Но вектор оказался непригоден, так как был нестабилен. Вектор SVGT5 был получен путем удаления из области поздних генов SV40 ДНК фрагмента, содержащего кодирующую часть белка VP1. В векторе сохранились поздний промотор, сигналы сплайсинга и полиаденилирования. В данном векторе клонировали кДНК и геномный ген β-глобина кролика. Базовыми элементами эукариотической экспрессионной кассеты является промотор и сайт полиаденилирования, в котором формируется 3’-конец транскрипта. Апробирование различных эукариотических экспрессионных кассет было проведено путем их конструирования в составе плазмиды pBR322 и временной экспрессией после трансформации клеток.