24. Мигрирующие элементы и конструирование векторов для клонирования хромосомных генов бактерий in vivo.

Ответ. Мигрирующими элементами (МЭ) называются последовательности ДНК, имеющие специфическую структуру и автономно перемещающиеся по геному. Гены, кодирующие это перемещение, локализованы в самих МЭ. К мигрирующим элементам бактерий относятся: простые вставочные последовательности; IS-элементы (от Insertion Sequences); транспозоны – Tn; конъюгативные транспозоны – CTn; интегроны – In; генные острова (ГО), включая острова патогенности (ОН). Первыми обнаруженными и изученными МЭ были IS-последовательности и транспозоны, перемещение которых осуществляется кодируемыми ими ферментами – транспозазами, которые могут связываться с однонитевыми ДНК. IS-элементы и Тп имеют общий принцип организации. В центре этих элементов находятся гены, окаймленные с двух сторон сначала инвертированными, а потом дуплецированными повторами. Инвертированные повторы – это повторяющиеся и инвертированные гомологичные последовательности ДНК, которые обусловливают возможность возникновения шпилечных структур в молекуле ДНК, способствуя прохождению в этом районе актов рекомбинации. Дуплецированные повторы возникают в ДНК-мишени, в которую встраивается МЭ, в результате ступенчатого разрыва двух нитей молекулы и достраивания пробелов по матрице одной оставшейся нити. IS-элементы представляют собой последовательности ДНК средних размеров – 500–1500 п.н. (редко встречаются более мелкие последовательности – около 200 п.н.). В центральной части эти элементы содержат только гены, кодирующие синтез небольших белков, необходимых для их перемещения – транспозиции. Инвертированные повторы имеют размеры от нескольких пар оснований до нескольких десятков пар. Транспозоны – это более крупные и более сложные МЭ, отличающиеся от IS-последовательностей тем, что в центральной части имеют гены, кодирующие какие-то фенотипические признаки бактерий. Очень часто это гены, определяющие устойчивость к антибиотикам, хотя могут быть и любые другие бактериальные гены. По строению транспозоны разделяются на два типа. У одного из них концевыми повторами служат IS-элементы, кодирующие транспозазы. Они могут быть инвертированными или прямыми. В последнем случае транспозон все равно фланкирован инвертированными повторами – небольшими инвертированными последовательностями IS-элемента. В центральной части такие транспозоны несут только гены, кодирующие какие-то фенотипически выявляемые признаки бактерий; очень часто это гены устойчивости к антибиотикам. Таких генов может быть несколько и от их числа в транспозоне зависит его размер. Транспозоны другого типа фланкированы короткими инвертированными повторами. У таких транспозонов гены, контролирующие транспозицию, находятся в центральной части вместе с генами, определяющими фенотипические признаки несущей транспозон бактерии. При перемещении IS-элементов и Тп транспозазы опознают их инвертированные повторы. При этом необходимы оба повтора. Родственные МЭ имеют сходные транспозазы. Транспозиция является высокоспецифичной системой рекомбинации, отличающейся от общей рекомбинации и не требующей строгой гомологии в последовательностях инвертированных повторов и мишени – негомологичная рекомбинация. При транспозиции МЭ встраиваются обычно в АТ-богатые районы ДНК. При этом чаще всего происходит локальный синтез ДНК МЭ, и новая его копия перемещается в другое место; старая же копия остается на прежнем месте. Такой механизм перемещения МЭ называется репликативной транспозицией. Значительно реже осуществляется эксцизионная транспозиция, когда МЭ вырезается из несущей его ДНК и перемещается в новое место. Внедрение различных МЭ в новую мишень происходит с разной степенью специфичности, причем последняя зависит как от МЭ, так и от мишени. Лучше всего специфичность внедрения разных МЭ изучена на Е. coli. У некоторых МЭ специфичность крайне низка – они внедряются практически в любые точки всех репликонов в бактериальной клетке. Есть МЭ со средней специфичностью – в бактериальном геноме много мест их внедрения как в разные гены, так и внутри отдельных генов. Некоторые МЭ характеризуются региональной специфичностью – они включаются в определенные районы генома протяженностью 1–2 т.п.о.; внутри этих районов вставка осуществляется практически в любую точку. Наконец, известны МЭ с высокой специфичностью включения в мишень – в одну или очень немногие точки хромосомы. Выше уже было сказано, что специфичность – явление относительное, поскольку зависит и от МЭ, и от мишени. Поэтому МЭ с высокой специфичностью включения в хромосому могут в той же клетке включаться во много точек плазмиды. Средние частоты транспозиции для IS и Тп составляют 10^–4–10^–7 при репликативной транспозиции и 10^–6–10^–9 – при эксцизии. При перемещении МЭ могут включаться как в другое место того же репликона, так и в другие репликоны в бактериальной клетке и далее с плазмидами или при делении клеток перемещаться в другие клетки бактериальной популяции или даже в клетки бактерий других видов и родов (на широкотрансмиссивных плазмидах). Внедрение в ДНК МЭ вызывает инактивацию генов-мишеней, т.е. мутации. Такие мутации могут быть обратимыми, если впоследствии произойдет точная эксцизия МЭ. Если эта эксцизия будет неточной, то активность гена-мишени не восстановится. Когда мутации, индуцированные внедрением МЭ, возникают в гене, входящем в состав какого-то оперона (совместно регулируемой группы генов, ответственных за единый метаболический процесс), они обычно бывают полярными, т. е. выключают не только тот ген, в который внедрился МЭ, но и все лежащие дистальнее гены. Полярный эффект обусловлен наличием в МЭ терминальных последовательностей, на которых обрывается считывание генетической информации. Внедряясь в молекулу ДНК, МЭ могут не только выключать, но и включать гены за счет присутствующих в них промоторных последовательностей или создания новых промоторов на стыках последовательностей МЭ и мишени. Другими словами, МЭ могут как выключать гены, так и регулировать их экспрессию. Мигрирующие элементы могут обусловливать мультипликацию генов в плазмидах и хромосомах бактерий. Лучше всего изучен этот процесс при мультипликации генов устойчивости к антибиотикам, но таким же образом могут быть мультиплицированы и другие гены бактериального генома. Устойчивость к ампициллину (и другим препаратам пенициллинового ряда) характеризуется многоступенчатостью. При первичном контакте бактерий с антибиотиком возникает устойчивость к определенной невысокой его концентрации. При дальнейшем культивировании бактерий на среде с этим антибиотиком, и особенно при повышении его концентрации, устойчивость бактерий к нему повышается ступенчато. Обусловлено это возникновением в его геноме структуры, состоящей из ряда генов устойчивости к ампициллину, фланкированных IS-элементами. Это образование напоминает расположенные рядом транспозоны с концевыми последовательностями в виде IS-элементов. Описанный тип многоступенчатой устойчивости формируется не только в случае применения антибиотиков ампициллинового ряда, но и при воздействии ауреомицином, хлорамфениколом, неомицином, террамицином, а также некоторыми красителями и солями металлов. Помимо описанных выше перестроек генома, мигрирующие элементы индуцируют в бактериальных клетках слияние репликонов – образование коинтегратов из различных плазмид или из хромосомы и плазмиды. Такие коинтеграты могут возникать с участием разных систем рекомбинации; их образование может быть обусловлено либо системами транспозиции самих мигрирующих элементов (транспозазами), либо системой общей рекомбинации, кодируемой хромосомой. В первом случае происходит объединение репликонов, если оба или один из них несет какой-либо мигрирующий элемент. При коинтеграции репликонов МЭ удваивается и фланкирует один из объединяющихся репликонов; копии его находятся в прямой ориентации и снаружи окаймлены дуплицированными участками ДНК мишени. Встраивание репликона происходит преимущественно в АТ-богатые районы молекул ДНК, так же как и встраивание любого МЭ. Образовавшийся коинтеграт может в дальнейшем разделиться. Каждый из возникших при этом репликонов несет по МЭ (т.е. происходит как бы размножение МЭ). Разделение коинтеграта может быть правильным и неправильным. В первом случае появившиеся после разделения репликоны ничем не отличаются от исходных (слившихся), только один из них получает МЭ, которого ранее в его составе не было. При неправильном разделении коинтеграта возникают два новых измененных репликона (с новыми последовательностями ДНК). Как было сказано выше, слияние репликонов может происходить и за счет общей, или гомологичной, рекомбинации, если оба репликона несут один и тот же МЭ. Стимулируемые МЭ хромосомные перестройки, включая и образование коинтегратов, происходят с достаточно высокой частотой и, значит, вносят существенный вклад в перераспределение генетического материала в бактериальной клетке. Способность осуществлять индуцируемые МЭ перестройки зависит как от МЭ, так и от структуры генов его хозяина. Поскольку подвижные гены могут перемещаться в пределах генома с одного места на другое, то они могут быть весьма эффективными векторами для передачи рекомбинантной ДНК. Генетическая трансформация с помощью векторов на основе транспозонов была впервые осуществлена на дрозофиле. С помощью транспозируемого элемента Р дрозофиле был передан ген, обуславливающий коричневую окраску глаз. Перенос генов при помощи транспозонов имеет большие преимущества, так как он происходит с высокой частотой и не влечет значительных перестроек интегрируемой ДНК. Кроме того, этим методом можно переносить достаточно большие фрагменты ДНК.