53. Бинарные системы.

Ответ. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-область, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, vir-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая – vir-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е.соli (в том числе и точку 25 начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. coli и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегративному вектору целевой ген и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с vir-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые vir-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток.

54. Вирусы как векторы для растений.

Ответ. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Лишь 1–2% от числа вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержащим. Именно они наиболее удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК и рассматриваются главными кандидатами на роль векторов для переноса генов в растения. Наиболее перспективным в этом отношении является вирус мозаики цветной капусты CaMV, поражающий в основном растения семейства Капустных. Частицы этого вируса имеют диаметр около 50 нм и содержат кольцевую ДНК длиной 8000 н. п. Небольшой размер генома CaMV дает возможность манипулировать in vitro с вирусной ДНК, как с бактериальной плазмидой и затем вводить ее в растения путем втирания в листья. Инфицирование небольшого числа клеток приводит к заражению всего растения, так как вирус быстро распространяется, передаваясь от клетки к клетке. Использованием 1–5 мкг ДНК для инфицирования одного растения достигается почти 100%-я эффективность инфекции, что значительно выше, чем при агробактериальном заражении. Прямая интеграция ДНК CaMV в геном хозяина после инфекции не показана. Разработан методический прием – агроинфекция, позволяющий осуществить прямое встраивание вирусной ДНК после инокуляции. Для этого геном CaMV встраивается в Т-ДНК и в ее составе интегрирует в ядерный геном различных растений, при этом из состава CaMV вырезаются последовательности, обеспечивающие его вирулентность. К преимуществам векторных систем на основе вирусов можно отнести следующие: малый размер генома, что дает возможность легко манипулировать вирусной ДНК; высокая копийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений (до 50000 на клетку); наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов. Среди недостатков следует отметить небольшую емкость вектора (800–1000 н.п.) и ограниченный круг хозяев – крестоцветные. В заключение следует отметить, что хотя векторы на основе вирусов редко применяются для трансформации растений, вирусные промоторы, и прежде всего промотор 35S-PHK CaMV, широко используются для экспрессии чужеродных генов в других векторных системах. Промотор 35S-PHK вируса мозаики цветной капусты является сильным промотором, кроме того, он активен не только в клетках крестоцветных, но и в клетках других семейств, не проявляет тканеспецифичности и экспрессируется во всех клетках трансформированного растения.