3. Механизмы реализации генетической информации.

Ответ. Реализация генетической информации в клетке — процесс, происходящий внутри каждой живой клетки, во время которого генетическая информация, записанная в ДНК, воплощается в биологически активных веществах — РНК и белках. Переход генетической информации от ДНК к РНК и от РНК к белку является универсальным для всех без исключения клеточных организмов. Этапы реализации генетической информации в клетк. Претранскрипционный. Это стартовый этап синтеза, во время которого происходит активация молекулы ДНК с помощью специальных белков. Транскрипционный-синтез и-РНК происходит в ядре, в процессе которого информация, содержащаяся в гене ДНК, переписывается на и-РНК с последовательностью нуклеотидов комплементарной молекуле ДНК. Транспортный охватывает период между транскрипцией и трансляцией. Над данном этапе происходит процессинг, т.е. созревание И-РНК. Суть его - удаление интронов (неинформ участки). Экзоны (триплеты, несущие информ об АК) сохр и соед-ся в единую цепь с помощью ферментов лигаз. Указанное явление наз-ся сплайсинг. Прошедшая сплайсинг и-РНК переносится из ядра в цитоплазму с помощью белков-переносчиков. Трансляцией наз-ся синтез полипептидной цепи из АК согласно кодирующей и-РНК. В ходе трансл происх перевод генетич информ в аминокислотную последовательность: ДНК, и-РНК, белок. Здесь выд-ся следующие этапы: инициация, элонгация, терминация (инициация — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза, элонгация — собственно синтез белка, терминация — узнавание терминирующего кодона (стоп-кодона) и отделение продукта). Посттрансляция. Происходит образование вторич ной и третичной структуры белка, то есть формирование окончательной структуры белка. Таким образом, в процессе биосинтеза белка образуются новые молекулы белка в соответствии с точной информацией, заложенной в ДНК. Этот процесс обеспечивает обновление белков, процессы обмена веществ, рост и развитие клеток, то есть все процессы жизнедеятельности клетки.

4. Молекулярное клонирование как способ исследования структурной организации генетических элементов и систем экспрессии чужеродной генетической информации.

Ответ. Молекулярное клонирование – клонирование молекул ДНК (в том числе генов, фрагментов генов, совокупностей генов, ДНК-последовательностей, не содержащих гены), другими словами – наработка большого количества идентичных ДНК-молекул с использованием живых организмов. Организм, который получает рекомбинантную ДНК, называется генетически модифицированным организмом (ГМО). Когда вводится чужая ДНК, имеющая происхождение от другого вида, организм-хозяин называется трансгенным. В основе генетической инженерии лежит целенаправленное конструирование искусственных генетических систем вне организма и их введение в живой организм с целью создания нового организма (или модификации существующего). Это предполагает, что часть генов можно с помощью специальных ферментов вырезать из молекулы ДНК одного организма (донорная ДНК) и перенести в другой, реципиентный, организм. Используемые для переноса генетические конструкции носят название рекомбинантных ДНК. В их состав входят фрагмент донорной ДНК (клонируемая ДНК) и векторная ДНК (вектор, который отвечает за перенесение и встраивание – интеграцию – клонируемой ДНК). Молекулы рекомбинантной ДНК создают для клонирования необходимых участков ДНК, картирования ДНК, создания трансгенных организмов, массового получения продуктов, закодированных данным участком ДНК. Рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и обеспечивают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства. Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов – обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего ферментов рестрикции (рестрицирующих эндонуклеаз, рестриктаз). Рестриктазы являются составной частью системы рестрикции – модификации прокариотических клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК. Система модификации осуществляет метилирование собственной ДНК в сайтах ее узнавания немедленно после репликации; чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с помощью рестриктаз. Различают три основных класса рестриктаз. Рестриктазы класса I разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью. Ферменты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Для их культивирования необходимы оптимальные условия (температура, состав и pH среды, концентрация кислорода и т.д.). С целью повышения продуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клонируют гены рестрицирующих эндонуклеаз в Е. coli. Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах). Каждый фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфическую последовательность из 4–6 нуклеотидов. Многие рестрицирующие эндонуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, располагаясь наискось друг от друга. В результате образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из 4-х нуклеотидов в каждом («липкие» концы). Кроме рестриктаз, расщепляющих нуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образованием ДНК с «тупыми концами». Одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе при спаривании липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы. Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и после их лигирования (соединения фосфодиэфирной связью) с векторной ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, например, объединяющих между собой фрагменты донорной ДНК и векторные ДНК. Для уменьшения количества последних рестрицированную векторную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.