31. Молекулярные векторы на основе генома бактериофага лямбда.

Ответ. Геном фага лямбда можно разделить на основные части. Левая часть включает все гены (от Nu1 до J), белковые продукты необходимые для формирования капсидов и упаковки в них молекул фаговой ДНК. Центральная часть, расположенная между генами J и N, несущественна для литического развития фага в клетке-хозяине дикого типа. Эта область генома содержит гены, участвующие в общей рекомбинации фага, сайтспецифической интеграции ДНК фага в бактериальную хромосому и исключении профага из хромосомы. Сайт-специфические рекомбинантные события происходят по особым участкам на ДНК фага и бактериальной хромосомы. Правая часть генома фага содержит все остальные контролирующие элементы, к которым относятся гены, необходимые для репликации фаговой ДНК (О и Р) и для лизиса клеток (Ѕ и К). Значительная часть ДНК (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного" фага, “вставшего" на литический путь развития. Рекомбинантные молекулы упаковывают в головки бактериофага λ in vitro и после добавления отростков получают инфекционные фаговые частицы. Приготовление экстрактов для осуществления упаковки in vitro ДНК фага λ проводят с помощью двух штаммов E.coli, каждый из которых лизогенен в отношении определенного мутантного штамма фага λ. Один из мутантов не способен синтезировать белок А (один из полипептидов фаговой терминазы), другой – белок Е (белок головки фага). Оба этих белка необходимы для упаковки ДНК фага λ. “А” – и “Е” – экстракты смешивают и добавляют конкатемерную (сегменты полноразмерной фаговой ДНК, полимеризованные по cos-сайтам) ДНК фага, которая связывается с терминазой прежде, чем происходит разрезание в cos-сайтах, и упаковывается в фаговые головки. При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т.п.н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т, п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку. Существующие в настоящее время векторные фаги лямбда для каждой конкретной рестриктазы делят на векторы внедрения и векторы замещения. Векторы внедрения имеют на ДНК одно место действия для данной рестриктазы. Если при встройке экзогенного фрагмента ДНК в этот сайт происходит нарушение какого-либо гена исходного фага, селекция гибридных клонов осуществляется как выявление соответствующих фаговых мутантов. К ним относят λplac5-1, лямбдаIV, лямбда598, лямбда607, лямбдаgtII. Пример: векторный фаг λplac5-1. При встройке экзогенной ДНк по единственному месту действия EcoRI нарушается ген β-галактозидазы (lacZ), и это легко детектируется в тесте титрования фагов на газоне E.coli lacZ- (штамм, не способный сбраживать лактозу) на чашках с индикаторным красителем. Β-галактозидаза катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу, что приводит к закислению окружающей среды. Изменение pH выявляется на питательной среде с лактозой и краистелем бромкрезоловым пурпурным. Исходный фаг λplac5-1 сбраживает лактозу, и бляшки, образуемые им, имеют желтое окрашивание. Гибридные фаги на основе λplac5-1 теряют β-галактозидазную активность, и формируют бляшки без изменения цвета. Векторы замещения имеют два или больше мест действия рестриктазы на молекуле фаговой ДНК. Заключенные между этими участками фрагменты векторной ДНК замещаются донорными фрагментами ДНК. При этом происходит делеция ряда генов фага, что детектируется соответствующими генетическими методами. Необходимо подчеркнуть, что делетироваться могут только гены, несущественные для литического развития фага. Векторы замещения 1-го поколения. Заключенный между местами рестрикции фрагмент векторной ДНК замещается экзогенной ДНК. При этом происходит удаление нескольких генов фага, что детектируетс генетическими методами. Удаляться могут только гены, несущественные для литического развития фага (область от J до N). Пример: вариант фага λ, в который можно встраивать фрагменты размером до 24 т.п.н., что составляет примерно ½ всей гибридной фаговой ДНК. Векторы замещения 2-го поколения. У них замещаемые фрагменты ДНК с двух сторон ограничены искусственными полилинкерами, содержащими участки узнавания нексольких различных рестриктаз. Например, широко используется в лабораториях векторный фаг λEMBL12, содержащий в полилинкерах места узнавания для 6 рестриктаз. Векторы замещения 2-го поколения позволяют встраивать фрагменты размером до 23 т.п.н. (1 т.п.н. идет на полилинкеры). Это дает возможность создавать на их основе библиотеки генов (клонотеки, геномные библиотеки). При этом геном изучаемого организма расщепляется на фрагменты «средние» щепящими рестриктазами (обычно Sau3AI и MboI). Перед встройкой в ДНК фага полученных фрагментов, среди них отбирают только фрагменты протяженностью 15–20 т.п.н., путем электрофоретического фракционирования. Таким образом, избегают встройки в ДНК фага двух или более несоседних в геноме фрагментов. При встройке 2 и более фрагментов размер гибридной ДНК будет превышать предельно допустимый: удобным инструментом при этом является упаковка ДНК в капсид. При упаковке ДНК в капсид in vitro произосходит отбор гибридных молекул размером от 38 до 51 т.п.н. Фрагменты ДНК в клонотеке можно идентифицировать по их порядку расположения в геноме, и при условии последовательного покрытия всего генома, такое собрание штаммов фага лямбда называют энциклопедией генов. Для этого используют векторы замещения 2-го поколения типа λDASH. Как оказывается, число клонов гибридной ДНК в энциклопедии гораздо меньше, чем в библиотеке, т.к. исключены крупные участки перекрывания и разного рода посторы. Например, для создания полной энциклопедии генов E. coliпришлось проанализировать 3400 гибридных клонов, а уже сформированная энциклопедия содержит 381 клон. Тем не менее, хранение целых генов в фаговых векторах не всегда возможно, т.к. многие гены гораздо длиннее, чем 23 т.п.н.