28. Характеристики pBr322, ее преимущества и недостатки.

Ответ. pBR322 – плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. pBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1); гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124) и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причём 2 сайта (HindIII и ClaI) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR. Участок репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1. Он кодирует две РНК (RNA I и RNA II) и один белок (Rom или Rop). Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину. Клетки E.coli, содержащие pBR322, выращивают на питательных средах c ампициллином или тетрациклином, либо с обоими антибиотиками. Если встроить какой-либо фрагмент ДНК по рестрикционному сайту, расположенному в одном из маркерных генов, то этот ген инактивируется. Так, при встраивании ДНК, например по сайту для эндонуклеазы рестрикции PstI, расположенному на участке, кодирующем устойчивость к ампициллину, не может синтезироваться белок, обеспечивающий рост клеток, содержащих такую рекомбинантную ДНК, на средах с ампициллином. Такие клетки способны расти на средах, содержащих тетрациклин, но не ампициллин. И наоборот, вставки сегментов ДНК по участкам узнавания ферментов, расположенных в гене устойчивости к тетрациклину, например HindIII или BamHI, оставляют возможность выживания клеток только на средах с ампицллином. При любой локализации вставки в молекуле вектора происходит отбор только тех бактериальных колоний, которые содержат рекомбинантные плазмидные ДНК. ДНК pBR322 разрезают эндонуклеазой рестрикции PstI в участке, определяющем устойчивость к ампициллину. Фрагменты донорной ДНК, также полученные с помощью PstI и имеющие липкие концы, как и линеаризованный вектор pBR322, с помощью ДНК-лигазы сшивают с векторной ДНК. Следствием образования такой конструкции является деструктурирование гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину. Таким образом, созданная рекомбинантная ДНК при введении в клетки E.coli не сможет обеспечить им выживание на среде с ампициллином. Клетки E.coli трансформируют рекомбинантной ДНК. Суспензию клеток после проведения процедуры трансформации высевают на чашки с агаром и питательной средой, содержащей антибиотик тетрациклин. На этом этапе происходит селекция, т.е. отбор клеток, которые способны расти на среде с тетрациклином. Выросшие на этом агаре клетки содержат рекомбинантную ДНК и ДНК pBR322, в которую не встроилась вставка донорной ДНК, т.е. восстановилась первоначальная структура вектора. Индивидуальные колонии клеток E.coli, выросшие на чашке с тетрациклином пересевают на чашки две чашки, одна из которых содержит агар с ампициллином, а вторая – с тетрациклином. Клетки, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК, растут только на агаре с тетрациклином, поскольку ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину у них деструктурирован за счет встраивания донорной ДНК. В то время как клетки с исходной, т.е. восстановленной векторной ДНК pBR322 растут на обеих чашках, поскольку гены устойчивости к обоим антибиотикам находятся в нативном, т.е. в исходном состоянии. Из клеток отобранных клонов E.coliэкстрагируют плазмидную ДНК и анализируют ее структуру. Создание плазмиды pBR322. Ряд плазмид E. coli имеют своего рода родословную. Путь конструирования pBR322 начался с участие pRSF2124 в pMB9 -> была получена плазмида pBR312, несущая маркеры Apr и Tcr. Из плазмиды pBR312 удалили одно из 2-х мест узнавания BamHI, и получили плазмиду pBR313. Затем через промежуточные плазмиды pBR318 и pBR320 получили pBR321, а случайную плазмиду с делецией, производную от pBR321, назвали pBR322. Таким образом, конструирование новых плазмид идет через перенос транспозонов, направленные делеции (для уменьшения размера плазмиды) и лигирования продуктов рестрикции плазмид.