6. Общие свойства клонирующих векторов. Принципы клонирования днк in vivo и in vitro.

Ответ. Для эффективного выполнения своей функции вектор должен отвечать определенным требованиям: быть репликоном, чтобы стабильно существовать в клетке; иметь селективный маркер, позволяющий отбирать трансформированные вектором клетки; иметь, по крайней мере, один единичный сайт рестрикции для внедрения в него чужДНК (подобные сайты будем в дальнейшем называть сайтами клонирования). Дополнительные свойства определяются целью клонирования генов. Поэтому большинство векторов носит специализированный характер, т. е. их приспосабливают для решения узкого круга задач. Например, векторы, предназначенные для экспрессии генов, содержат около сайтов клонирования мощные промоторы, причем экспрессия может быть регулируемой или нерегулируемой (конститутивной). Присутствие в таких векторах специальных сигнальных последовательностей обеспечивает секрецию продуктов клонируемых генов. Малокопийные векторы позволяют изучать, например, механизмы регуляции клонируемых генов, а мультикопийные способны умножать (амплифицировать) их число в сотни и тысячи раз. Разработаны векторы для секвенирования нуклеотидных последовательностей и для поиска в них определенных регуляторных сигналов – промоторов, терминаторов транскрипции, антитерминаторов и т. д. Векторы прямой селекции позволяют выживать только таким трансформантам, которые содержат рекДНК. Сконструированы векторы, имеющие широкий круг клеток-реципиентов. Имеются челночные векторы, способные реплицироваться в клетках, относящихся даже к разным царствам. Векторы, как правило, создают такими, чтобы они могли нарабатываться в препаративных количествах. Это достигается использованием при их конструировании репликаторов мультикопийных плазмид или фагов с высокой продуктивностью (фаг X и нитевидные фаги), позволяющих получать от нескольких десятков до тысячи векторных молекул на клетку. Важно также предусмотреть в конструкции вектора возможность легкого вычленения ("вырезания") клонируемых генов. Для клонирования в клетках животных чаще всего используются векторные системы, созданные на основе геномов вирусов. Для введения чужеродных генов активно применяют векторные молекулы на основе ретровирусов (вирус лейкемии мышей, ВИЧ-1). Векторы на основе Ti-плазмид являются основными системами для переноса чужеродной генетической информации в клетки растений. Эксперименты по клонированию включают следующие этапы. Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК). Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую геном. Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для клонирования, который может реплицироваться в клетке-хозяине. Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Введение этой конструкции в клетку хозяина (реципиента), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроизводит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки). Получение специфичного белкового продукта, синтезированного клетками-хозяевами. Процесс молекулярного клонирования in vivo (в живых клетках) включает следующие этапы: получение целевого фрагмента ДНК –> выбор вектора –> создание рек-ДНК –> выбор хозяина –> введение вектора в популяцию восприимчивых клеток хозяина –> отбор успешно трансформированной (трансгенной) клетки –> размножение данной клетки –> выделение векторных молекул из клетки –> выделение целевого фрагмента ДНК. Клонирование в живых клетках является альтернативой амплификации фрагмента in vitro (в пробирке). Клонирование in vitro ведется с помощью полимеразной цепной реакции. При этом выделенный из клеток фермента ДНК-полимераза, находясь в среде определенной кислотности, ионной силы, при наличии ДНК-матрицы, строительных блоков (мононуклеотидов) и чередовании циклов денатурации-ренатурации ДНК, создает большое число копий целевого фрагмента ДНК. Удобное клонирование in vitro было изобретено относительно недавно, с открытием термостабильной ДНК-полимеразы бактерии Thermus aquaticus и с внедрением приборов, поддерживающих циклический температурный режим – термоциклеров. До внедрения таких приборов, клонирование in vitro производилось «вручную», т.е. с поочередным нагреванием реакционной смеси на водяной бане и охлаждением в холодильнике, повторяя цикл 15–20 и более раз.