37. Конструкция и использование векторов на основе нитевидных фагов.

Ответ. Наличие в фаговом геноме области, несущественной для его жизнедеятельности, является важным условием использования этого фага для конструирования гибридных молекул ДНК. У нитевидных фагов существует лишь межгенная область размером 500 нуклеотидов, в которой могут быть произведены изменения (делеции, вставки) без нарушения жизнеспособности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеет участков узнавания многих рестриктаз, образующих при гидролизе липкие концы, а кроме того, фаговый геном не содержит генетических маркеров, которые позволили бы легко выявлять гибридные фаги. Поэтому конструирование векторных нитевидных фагов включает в себя прежде всего введение в геном селективных маркеров и уникальных участков расщепления определенными рестриктазами. Использование векторов на основе фага М13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага М13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК. При первой попытке использовать дикий фаг М13 в качестве вектора для молекулярного клонирования был проведен эксперимент, направленный на выявление области фага M13, в которую можно было внедрять фрагменты чужеродной ДНК без ущерба для жизнедеятельности фага. В качестве маркерной молекулы был выбран HindII-фрагмент β-галактозидазы, который, как было известно, в условиях α-комплементации с аналогичным геном LacZΔM15, несущим мутацию и расположенным на хромосоме E.coli, мог формировать функциональный фермент и при добавлении соответствующего хромогенного субстрата и индуктора давать голубое окрашивание. Было осуществлено недорасщепление фага М13 рестрикционной эндонуклеазой BsuI, имеющей в этом векторе 10 сайтов узнавания, и с помощью гель-электрофореза отобраны линейные формы с единичными разрывами цепи. В результате клонирования HindII-фрагмента β-галактозидазы был отобран фаг, стабильно наследующий данный признак, обозначенный как M13mpl. Местом клонирования вставки оказалась межгенная область между II и IV генами фага. Следующим этапом совершенствования данного вектора для молекулярного клонирования было добавление во фрагмент гена β-галактозидазы, обозначаемого как LacZ', уникального сайта рестрикционной эндонуклеазы EcoRI, осуществленное с помощью химического мутагенеза, в результате чего образовались вектора М13тр2 и М13трЗ. Дальнейшие улучшения векторов на основе одноцепочечного фага М13 привели к последовательному добавлению уникальных сайтов узнавания для рестрикционных эндонуклеаз HindIII и ВатHI. Однако это был еще не настоящий полилинкер, а, скорее, его прообраз. Настоящая революция в создании векторов произошла после помещения в маркерный β-галактозидазный ген химически синтезированного участка ДНК, содержащего расположенные друг за другом уникальные сайты узнавания для целого ряда гексануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, пригодные для их использования в клонировании. Первые сконструированные полилинкеры представляли собой симметричные последовательности, несущие по два сайта узнавания некоторых рестрикционных эндонуклеаз, как, например, EcoRI-ВатHI-SalI-PstI-SalI-BamHI-EcoRI. Создание впоследствии асимметричных полилинкеров в векторе М13mp9 или ему подобных, привело к возможности использования для выделения вставки одновременно двух разных ферментов, узнающих отличающиеся последовательности и образующих как 5', так и 3'-выступающие концы, что было необходимо или для мечения только одного из них, или переклонирования в другом векторе в заранее заданной ориентации. Последовательности полилинкеров были сконструированы таким образом, что не нарушали рамку считывания NH2-терминального фрагмента β-галактозидазы, но при клонировании какого-либо фрагмента ДНК функциональная целостность фермента нарушалась и при использовании специального хромогенного субстрата 5-бромо-4-хлоро-галактозида (x-gal) и индуктора изопропил-(3-тиогалактозида (ИПТГ) легко выявлялись рекомбинантные бактериофаги, несущие вставки. Отдельные случаи сохранения голубого окрашивания рекомбинантными фаговыми бляшками, равно как плазмидами и фагмидами, происходят вследствие клонирования небольших вставок с количеством нуклеотидов кратным 3, что не приводит к нарушению рамки считывания гена β-галактозидазы (конечно, при условии отсутствия терминирующих кодонов во вставке). В течение ряда лет была сконструирована целая серия одноцепочечных векторов М13тр, отличающихся только своими полилинкерами (М13тр6, М13тр7, М13тр8, М13тр9 и др.). Следует отметить, что до недавнего времени продолжались работы по улучшению векторов данного семейства и им подобных. Все это было вызвано тем, что одноцепочечные вектора на основе фага М13 оказались крайне удобными при выполнении проектов по секвенированию фрагментов ДНК ферментативным методом Сэнгера.