47. Введение молекул днк в клетки млекопитающих.

Ответ. Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат – получение трансгенных организмов. Одними из лучших носителей для введения чужеродной информации в животную клетку являются вектора на основе ретровирусов, например, на основе вируса лейкоза мышей. Они обеспечивают высокоэффективный перенос генов и их стабильное встраивание в хромосому клеток-мишеней. В основном трансформации животных клеток осуществляют либо с помощью ретровирусов (около 40% от всех трансформаций), либо путем упаковки ДНК в липосомы (25%), реже используют аденовирусы, так как они могут вызывать сильный иммунный ответ, кроме того, невозможно их повторное введение. В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (MAC). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Такие искусственные хромосомы уже созданы для дрожжей (YAK), так как геном дрожжей полностью картирован. Клетки млекопитающих, как правило, не восприимчивы к чужеродной ДНК (например, к очищенной ДНК вируса), если она находится в растворе за пределами клетки. ДЭАЭ-декстрановый метод. Довольно прост и дает высоковоспроизводимые результаты. В 1968 году было показано, что поликатион диэтиламиноэтилдекстран (ДЭАЭ-дестран) значительно увеличивает эффективность включения ДНК в клетки. Эффективность включения зависит от молекулярной массы ДЭАЭ-декстрана. Механизм действия ДЭАЭ-декстрана не установлен. По-видимому, этот поликатион связывается с ДНК и защищает ее от действия нуклеаз. ДЭАЭ-декстран изменяет физические свойства плазматической мембраны и стимулирует пиноцитоз. Недостаток метода – ДЭАЭ-декстран в высоких концентрациях токсичен для клеток. Метод распространения в генотерапии не получил. Кальций-фосфатный метод (Са2+-претипитации). Является модификацией ДЭАЭ-декстранового метода. На монослой клеток КВ, предварительно обработанных ДЭАЭ-декстраном, наносят ДНК аденовируса Аd5 в растворе СаCl2. При этом эффективность трансфекции повышается в 10–100 раз. Аналогичные результаты получаются, когда клетки не обрабатывают ДЭАЭ-декстраном. Поскольку в питательной среде присутствуют фосфаты, при добавлении раствора хлорида кальция образуется осадок фосфата кальция. Удаление этого осадка из среды приводит к потере инфекционности ДНК. Таким образом, трансфекция происходит в результате соосаждения вирусной ДНК и образующихся микрокристаллов фосфата кальция на клеточный монослой. На примере ДНК вируса простого герпеса показано, что сразу после соосаждения с фосфатом кальция вирусная ДНК становится устойчивой к разрушению ультразвуком, но комплекс фосфат кальция – ДНК остается чувствительным к ДНКазе в течение 4 ч. При взаимодействии этого комплекса с культурой клеток животных ДНК становится устойчивой к ДНКазе уже в течение первого часа. ДНК образует с фосфатом кальция прочный комплекс, который при оптимальных условиях поглощают практически все реципиентные клетки. Эффективность поглощения клетками комплекса фосфат кальция – ДНК в значительной степени зависит от рН, при котором формировался этот комплекс, и концентрации ДНК. Важно, чтобы осадок фосфата кальция получился мелкодисперсным. Но даже в оптимальных условиях проведения трансфекции данным методом лишь в 1–5% клеток комплекс достигает ядра. По-видимому, проникновение ДНК из цитоплазмы в ядро является критическим этапом, наиболее сильно влияющим на эффективность трансфекции клеток вирусной ДНК. Кальций-фосфатный метод обычно более эффективен, чем ДЭАЭ-декстрановый, при трансфекции линейными вирусными ДНК и заметно уступает последнему при использовании кольцевых молекул ДНК. Вероятно, образование микрокристаллов фосфата кальция и соосаждение с ними молекул ДНК сопровождается нарушением структуры части этих макромолекул. Особенно данный эффект сказывается на лабильных кольцевых молекулах ДНК, которые после разрыва цепей и перехода в линейную форму уже не инфекционны. ДЭАЭ-декстрановый метод, как более мягкий, обеспечивает значительно большую эффективность проникновения кольцевых молекул ДНК в клетки животных в неповрежденном виде, хотя в целом доля клеток, поглотивших ДНК при обработке ДЭАЭ-декстраном, существенно меньше, чем при трансфекции кальций-фосфатным методом. Метод микроинъекций ДНК. В цитоплазму или прямо в ядро клетки вводят раствор ДНК объемом 10-8 мкл с помощью микрокапилляра; процедура проводится на предметном столике микроскопа с помощью микроманипулятора. Преимущество – можно ввести ДНК прямо в ядро. Недостаток – сложность метода, высока вероятность разрушения ядра либо ДНК. В настоящее время микрокапилляр заменен на микроиглу. Недостаток – можно трансформировать ограниченное число клеток. Сегодня этот метод используется для создания трансгенных животных для введения экзогенной ДНК в ядро. Например, метод дает результаты при введении целевого гена на плазмиде рBR 322 в ядра мышиных клеток. В генотерапии не используется ввиду запрещения работ с половыми клетками человека. Метод прокалывания. Монослой клеток заливается раствором, содержащим плазмидный вектор, и клетки прокалываются микроиглой. Эффективность трансформации 25%. Электропорация. К клеткам многих типов можно ввести ДНК с помощью высоковольтного электрического разряда (2 тыс. – 4 тыс. вольт) В основе этого метода лежит образование в мембране репарируемых отверстий, через которые проникает ДНК. Сегодня это один из основных методов введения ДНК внутрь клеток эукариотических организмов. В генотерапии на сегодняшний день не используется. «Генное ружье». Этот метод применяется in vitro и in vivo для введения генов в клетки мышечных тканей. Например, для введения ДНК в мышечную ткань при мышечной дистрофии Дюшена. Генная пушка доставляет частицы тяжелых металлов, покрытые плазмидной ДНК. Размеры частиц золота – 1–3 мкм. Недостатком этих методов является нестабильность вводимой ДНК в клетках и низкая эффективность встраивания генов в геном. Методика не применима в случае быстрорастущих клеток и требует многократного инъецирования. Не все типы тканей пригодны для введения ДНК этим способом. Недостаток: низкий уровень экспрессии трансгена. Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Липосомы – сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Для эукариотических клеток трансфекция производится эффективнее с применением катионных липосом, потому что клетки к ним более чувствительны. Процесс имеет своё название – липофекция. Этот метод сегодня считается одним из самых безопасных. Липосомы нетоксичны и неиммуногенны. Однако, эффективность переноса генов с помощью липосом ограничена, поскольку внесенная ими ДНК в клетках обычно сразу же захватывается лизосомами и разрушается. Введение ДНК в клетки человека с помощью липосом сегодня является главным при терапии in vivo. Метод прямого переноса плазмид из бактерий в клетки животных. Перспективным подходом к введению плазмидных ДНК в клетки млекопитающих стал разработанный В. Шаффнером в 1980 г. метод прямого переноса плазмид из бактерий в клетки животных. Метод основан на слиянии сферопластов клеток Е. Colli с клетками животных. Для этого сферопласты осаждают на монослой клеток в искусственном поле тяжести (центрифугирование) при добавлении полиэтиленгликоля, который снижает отрицательный заряд на поверхности сферопластов и клеток и тем самым облегчает их слияние. Бактериальные клетки предварительно инкубируют с ингибитором белкового синтеза – хлорамфениколом. В этих условиях плазмиды с ослабленным контролем репликации амплифицируются и их копийность достигает нескольких тысяч на клетку. Повышенная копийность плазмиды обеспечивает высокую частоту ее проникновения в клетки животных. Другим достоинством данного метода является то, что для введения плазмид в клетки животных отпадает необходимость в наработке и очистке плазмидной ДНК. Электропорация – очень популярный метод; мгновенное повышение проницаемости мембраны достигается за счет того, что клетки подвергаются коротким воздействиям интенсивного электрического поля (2–2.5 кВ/см, в течение 1 мс, в присутствии катионов Ca и Mg). Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. На человеке на сегодняшний день не используется. Введение с помощью реконструированных in vitro вирусоподобных частиц. Плазмида рМВ9 и pBR322 вводят в реконструированные оболочки вирусов (например вируса папилломы). Стабильные искусственные вирусоподобные частицы используют для трансфекции клеток. Векторные молекулы ДНК в клетках млекопитающих обычно нестабильны. Например, в клетках хомяка плазмида CoIE1 гидролизуется в течение нескольких суток. Плазмида pBR322 также деградирует в клетках хомяка. Однако, pBR322 реплицируется в клетках мартышки линии CV-1. Эта плазмида наблюдалась в автономном состоянии клеток мартышки даже после 5 пассажей культуры. Это объясняется наличием в данной плазмиде репликатороподобной последовательности, частично гомологичной ori ДНК вируса SV40. Таким образом, стабильность бактериальных плазмид может быть обусловлена случайными последовательностями, похожими на участки инициации репликации, свойственные млекопитающим и их вирусам.