3.5.1. Определение группового и фракционного состава гумуса по методу и.В. Тюрина в модификации в.В.Пономаревой и т.А.Плотниковой

Анализ состава гумуса по этой методике дает возможность выделить три фракции Гк и четыре фракции Фк. Кроме этого определяется величина негидролизуемого остатка (гумин), которая характеризует прочность закре­пления гумусовых веществ минеральной частью почвы или слабую степень гумификации органического вещества, как например, в торфе, лесной под­стилке и т.п. При необходимости выделяется фракция липидов. Схема ана­лиза включает следующие операции:

С первой навеской почвы:

непосредственная 0,1 н NaOH– вытяжка № 1 (остаток почвы выбрасывается)

Со второй навеской той же почвы:

Экстрагирование спирто-бензольной смесью (липиды)

декальцинирование 0,1 н H₂SO₄- вытяжка № 1^а(декальцинат)

Остаток почвы + 0,1 н NaOH– вытяжка № 2

Остаток почвы + 0,02 н NaOHпри 6-часовом нагревании на водяной бане – вытяжка № 3

нерастворимый остаток гумуса (гумин)

При фракционировании гумуса можно определять в получаемых вытяжках не только углерод, но и азот. В этом случае необходимо в два раза увеличить навески почв и объемы растворителей. Очень важно соблюдать по возможности строго одинаковые условия фракционирования гумуса: coотношение навесок почв с растворителями, время взаимодействия экстрагентов с почвой и их концентрацию, температурные условия.

1. Определение фракции воско-смол и битумов (по современной терминологии липидов). Это определение авторы считают необязательным для большинства минеральных почв и рекомендуют только при анализе органического вещества торфяных почв, лесных подстилок и при специальных исследованиях. Для этого навески почв 10-20 г экстрагируют в аппарате Сокслета смесью спирта и бензола (1:1) до полного осветления растворителя. Общее количество этой фракции определяют по весу после отгонки растворителя и высушивания остатка до постоянной массы при температуре 70-80^о. Содержание веществ, растворимых в спирто-бензольной смеси, вычисляют или в процентах к почве, или в процентах к общему углероду органического вещества почвы. Для пересчета на углерод принимают содержание углерода в этой фракции равным 72%.

Дальнейший ход анализа разделяется на две параллельные ветви: непосредственная щелочная вытяжка из отдельно взятой навески почвы и по­следовательное выделение различных фракций органического вещества из другой навески той же почвы.

2. Непосредственная 0,1 н. NaOH - вытяжка № 1. В эту вытяжку переходят гумусовые вещества свободные и связанные преимущественно с подвижными полуторными оксидами.

Из подготовленного образца почвы (пропущенного через сито с диаметром отверстий 1 мм) берут в конические колбы на 300-400 мл навески от 2,5 до 20 г в зависимо­сти от содержания в почве общего гумуса. Рекомендуется придерживаться следующих навесок:

2,5 – 5,0 г	при содержании в почве гумуса	> 10%
5 – 10 г	--«---«---	10 – 3%
10 – 15 г	--«---«---	3 – 0,5%
20 г	--«---«---	< 0,5%

К навескам приливают из мерной колбы по 200 мл 0,1 н. раствора NaOH, почву хорошо перемешивают с растворителем, колбы закрывают пробками и оставляют на 20-24 часа. В течение дня содержимое колб периодически перемешивают.

На следующий день в колбы приливают пипеткой точно 50 мл насыщенного раствора Na₂SO₄ (1/4 объема жидкости) для коагуляции илистых частиц и ускорения фильтрации, хорошо перемешивают растворы, оставляют колбы в покое на 10-15 мин, снова перемешивают непосредственно перед фильтрацией и фильтруют через простой бумажный фильтр диаметром 15-17 см. При фильтрации, особенно в самом начале, необходимо перенести на фильтр раствор вместе с почвой, чтобы заполнить поры фильтра почвенными частицами. Если первые порции фильтрата получаются мутными, их снова выливают на фильтр, добиваясь абсолютной прозрачности фильтрата. Фильтрацию можно заменить центифугированием вытяжки при 6000 тыс. и более оборотов в минуту в течение 30 мин. Остаток почвы выбрасывают. В отдельных порциях полученной щелочной вытяжки определяют содержание углерода вытяжки, Гк и Фк.

Общее содержание органического углерода вытяжки С_общ. В конические колбочки на 100 мл берут от 10 до 50 мл вытяжки в зависимости от густоты ее окраски. Прибавляют немного прокаленной пемзы и выпаривают на водяной бане досуха. Органический углерод в сухих остатках определяют по методу И.В.Тюрина в двух повторностях, в случае расхождения определение следует повторить.

Следует учесть, что точность определения органического углерода в вытяжках, так же как и в почвах, зависит в общем от содержания С во взятой пробе. Нужно стремиться к тому, чтобы на окисление испытуемой пробы расходовалось около половины взятого количества хромовой смеси. Если на окисление затрачивается больше половины взятого окислителя, что сопровождается позеленением раствора, результаты определения С будут заниженными, так как при концентрации Сr₂O₇^2- ниже 0,2 н. уменьшается полнота окисления гумуса. Как считают В.В. Пономарева и Т.А. Плотникова (1980) определение углерода по методу И.В. Тюрина можно считать надежным, если разница между холостым и испытуемым титрованием составляет не менее 2 и не более 8-10 мл 0,2 н. раствора соли Мора при величине холостого титрования 20-22 мл. В противном случае нужно повторить определение С, взяв для этого большую или меньшую пробу раствора.

Содержание углерода гуминовых кислот С_Гк. В небольшой стакан на 100-200 мл берут пипеткой 50-100 мл щелочной вытяжки и прибавляют к ней двойное эквивалентное количество 1 н. H₂SO₄, то есть соответственно 10 или 20 мл, с таким расчетом, чтобы рН был в пределах 1-2. Содержимое стаканчика нагревают на водяной бане до 70-80° и после некоторого отстаивания отфильтровывают выпавший осадок Гк через небольшой беззольный фильтр - белая или синяя лента. Осадок Гк в стаканчике и на фильтре промывают 2-3 раза 0,05 н. раствором H₂SO₄ для удаления механически задержанных фульвокислот. После этого приступают к растворению гуминовых кислот. Воронку с осадком Гк вставляют в мерную колбу на 100 мл и растворяют осадок небольшими порциями горячего 0,1 н. раствора NaOH. Предварительно горячим раствором 0,1 н. NaOH тщательно ополаскивают стаканчик, так как на его стенках всегда остаются частички гуминовых кислот. Растворившиеся в стаканчике Гк переносят на фильтр, где находится основная масса осадка Гк. Щелочной раствор доводят в мерной колбе до метки и отсюда берут пипеткой в зависимости от окраски раствора Гк 5-25 мл для определения углерода. Определение проводится так же, как и определение общего углерода щелочной вытяжки.

Содержание углерода фульвокислот С_Фк. находится по разности между С_общ щелочной вытяжки и С_Гк.

Из другой навески почвы последовательно выделяют различные фракции гумуса.

3. Декальцирование почвы. Такие же навески почв, какие были взяты для непосредственной щелочной вытяжки, помещают в конические колбы на 250 мл и приливают 200 мл 0,1 н. раствора H₂SO₄, перемешивают, закрывают пробками и оставляют до следующего дня. На другой день вытяжки отфильтровывают в колбы на 500 -1000 мл (в зависимости от содержания в почве обменного Са и длительности его отмывания) через бумажный фильтр средней плотности, перенося на него вместе с раствором и почву. Сначала обработку проводят декантацией, а затем переносят всю почву на фильтр и продолжают промывание почвы на фильтре 0,1 н. раствора H₂SO₄ до полного вытеснения кальция. Пробу на кальций проводят с щавелевокислым аммонием.

Проба с щавелевокислым аммонием. В пробирку приливают около 3 мл фильтрата, приливают несколько капель 10%-ного раствора NaOH до слабого запаха, подкисляют 10% раствором СН₃СООН, добавляют 3 мл 4% раствора щавелевокислого аммония и нагревают до кипения. При наличии кальция в фильтрате появляется белая муть или осадок щавелевокислого кальция. При отсутствии мути обработку почвы кислотой заканчивают.

После вытеснения обменного кальция почву на фильтре промывают 2-3 раза дистиллированной водой, слабо подкисленной серной кислотой, для удаления из навесок избытка серной кислоты. Сернокислую вытяжку вместе с промывными водами переносят в мерную колбу, доводят до определенного объема (250-500-1000 мл) и хорошо перемешивают. В вытяжках определяют содержание органического углерода по методу И.В. Тюрина. Для этого выпаривают 10-100 мл вытяжки (в зависимости от ее окраски), предварительно нейтрализовав её сухой содой или 1 н. раствором NaOH до начала выпадения полуторных оксидов. Следует учитывать, что органические вещества декальцината неустойчивы к микробиологическому разложению, поэтому анализ их нельзя откладывать больше чем на 2-3 дня.

При наличии в почве свободных карбонатов для декальцирования используют l н. соляную кислоту, которую приливают к почве небольшими порциями, постоянно перемешивая до прекращения вскипания. По окончании реакции разложения карбонатов к почве прибавляют 200-250 мл 0,1 н. НС1 и оставляют до следующего дня. На другой день отфильтровывают вытяжку и продолжают промывать почву на воронке сначала 0,1 н. раствором НС1 до удаления Са, а после этого - 0,1 н. раствором H₂SO₄ до удаления С1. Наличие в солянокислой вытяжке огромного количества С1, который окисляется хромовой смесью, препятствует определению в ней углерода и определение органических веществ декальцината в карбонатных почвах обычно не проводится.

4. 0,1 н. NaOH-вытяжка №2 после декальцирования почвы. В эту вытяжку переходят гуминовые и фульвокислоты, извлекаемые непосредствен­ной щелочной вытяжкой № 1, а также Гк и Фк, растворимые в щелочи только после удаления из почвы обменного кальция.

Сразу после декальцирования влажные навески почвы смывают с фильтра в те же колбы, где производилось декальцирование. Замедление этой операции приводит к подсыханию почвы, вследствие чего ее будет трудно полностью смыть с фильтра. Эта операция требует большой тщательности и осторожности. Лучше всего ее проводить следующим образом. В колбу, куда должна быть смыта навеска почвы, вставляют воронку диаметром 10-15 см с коротким и широким горлом. В небольшую чистую промывалку наливают точно 200 мл 0,1 н. раствора NaOH и этим количеством щелочи стараются смыть с фильтра, не вынимая его из воронки, всю почву обратно в колбу. Следует избегать разбрызгивания раствора щелочи и частиц почвы.

После данной операции на фильтре иногда остается незначительный налет мелких частиц почвы. Поэтому необходимо остатки щелочи в промывалке вылить на фильтр, чтобы они растворили то незначительное количество гумусовых веществ, которое могло задержаться с частичками почвы на фильтре. Остатком отмеренного количества щелочи обмывают и широкогорлую воронку, вставленную в колбу.

Если взятого количества щелочи не хватило на смывание почвы с фильтра, следует добавить в промывалку еще 50 или 100 мл 0,1 н. раствора NaOH и продолжить смывание почвы в ту же колбу, хотя это нежелательно, поскольку нарушается принятое соотношение почвы с растворителем.

После того как навески почвы полностью смыты в колбы и остатки раствора щелочи в промывалке вылиты в соответствующие колбы, их закрывают пробками и оставляют до следующего дня (на 20-24 часа). В тече­ние дня содержимое колб несколько раз перемешивают.

На следующий день в колбы прибавляют 50 мл насыщенного раствора Na₂SO₄ для коагуляции коллоидов и ускорения фильтрации. Содержимое колб хорошо перемешивают и оставляют на 10-15 минут, выжидая свертывания илистых частиц, после чего снова перемешивают и сразу фильтруют через бумажный фильтр, перенося на них раствор вместе с почвой. Остатки почвы в колбах и на воронках промывают 1-2% раствором Na₂SO₄ до обес­цвечивания промывных вод. Фильтрование можно заменить центрифугированием. Щелочную вытяжку вместе с промывными водами доводят до определенного объема и перемешивают. В отдельных порциях ее определяют содержание общего углерода вытяжки (С_общ) и углерода гуминовых кислот (С_Гк) методом Тюрина точно так же, как описано выше для щелочной вытяжки № 1. Содержание С_Фк находят по разности между С_общ и С_Гк.

5. 0,02 н. NaOH - вытяжка № 3 при нагревании на водяной бане. В эту вытяжку переходят гуминовые и фульвокислоты прочно связанные с глинистыми минералами и устойчивыми формами полуторных оксидов.

Остаток почвы после предыдущей вытяжки смывают в ту же колбу, как описано выше 200 мл 0,02 н. раствора NaOH. Колбы накрывают часовым стеклом во избежание испарения жидкости и ставят на кипящую водяную баню на 6 часов. По истечении 6 часов колбы снимают с бани, закрывают пробками и оставляют до следующего дня. На другой день в колбы добавляют по 50 мл насыщенного раствора Na₂SO₄ и через 10-15 минут отфильтровывают или центрифугируют. Почву в колбах и на фильтре промывают 1-2% раствором Na₂SO₄ до обесцвечивания промывных вод. Вытяжку вместе с промывными водами доводят до определенного объема и определяют С_общ, С_Гк и С_Фк , как описано выше для предыдущих щелочных вытяжек.

6. Определение остатка гумуса, нерастворимого при данной схеме анализа. Для обычных аналитических работ авторы метода рекомендуют определять углерод остатка по разности между общим содержанием органического углерода почвы и суммой углерода в выделенных фракциях гумусовых веществ.

Описанная методика дает возможность определить в составе почвенного гумуса следующие фракции гуминовых кислот и фульвокислот:

Гуминовые кислоты.

Фракция 1 - растворимая в 0,1 н. растворе NaOH без декальцирования почвы - свободная и связанная с подвижными полуторными оксидами.

Фракция 2 - растворимая в 0,1 н. растворе NaOH только после декаль­цирования почвы и связанная в основном с кальцием.

Фракция 3 - растворимая в 0,02 н. растворе NaOH при 6- часовом нагревании на водяной бане - связанная с глинистыми минералами и устойчивы­ми полуторными оксидами.

Фульвокислоты.

Фракция 1^а - растворимая в 0,1 н. H₂SO₄ при декальцировании почвы - свободная и связанная с подвижными полуторными оксидами (так называемая "агрессивная" фракция);

Фракция 1 - растворимая в 0,1 н. растворе NaOH без декальцирования почвы и связанная в почве с фракцией 1 гуминовых кислот;

Фракция 2 - растворимая в 0,1 н. растворе NaOH только после декальцирования почвы и связанная с фракцией 2 гуминовых кислот;

Фракция 3 - растворимая в 0,02 н. растворе NaOH при 6- часовом нагревании на водяной бане и связанная с фракцией 3 гуминовых кислот.

Количество гуминовых кислот фракций 1 и 3 находят без дополнительных пересчетов, по результатам анализов непосредственной вытяжки № 1 и щелочной вытяжки при нагревании № 3. Количество гуминовых кислот фракции 2 находят путем вычитания из количества Гк щелочной вытяжки № 2 после декальцирования почвы количества Гк в непосредственной щелочной вытяжке № 1.

Фракция 1^а фульвокислот соответствует результатам анализа декальцината, фракция 3 - содержанию Фк в щелочной вытяжке № 3 при нагревании.

Фракция 1 Фк находится как разность между содержанием Фк в не­посредственной щелочной вытяжке № 1 и декальцинате. Чтобы найти фрак­цию 2 Фк необходимо суммировать количество Фк найденное в декальци­нате и в щелочной вытяжке № 2 после декальцирования почвы и вычесть из этой суммы количество Фк, найденное в непосредственной щелочной вытяжке № 1.

Вычисление результатов опыта

Результаты определения группового и фракционного состава гумуса выражают в процентах от массы почвы (до второй цифры после запятой) и в процентах к общему содержанию углерода почвы (до первого знака после запятой).

Содержание липидов находят по формуле:

где m₂ – найденное в опыте количество липидов (г); m₁ – навеска почвы (г).

Содержание углерода липидов в % от массы почвы равно:

а в процентах к общему содержанию углерода почвы:

где С_общ – общее содержание углерода в почве, %.

Общее содержание углерода (С_общ) в % от массы почвы в декальцинате и щелочных вытяжках находят по формуле

где m – навеска почвы, г; н. - нормальность раствора соли Мора; 0,003 – молярная масса эквивалента углерода, г/моль; V₀ – общий объем декальцината или щелочной вытяжки, мл; V_в – объем декальцината или щелочной вытяжки взятый для выпаривания, мл; V₁ – количество раствора соли Мора, пошедшее на титрование хромовой смеси в холостом опыте, мл; V₂ – количество раствора соли Мора, пошедшее на титрование хромовой смеси в анализируемом образце, мл.

Пример расчета. Для приготовления 0,1 н. NaOH вытяжки к 5 г почвы прилито 200 мл 0.1 н. раствора NaOH. После настаивания суспензии для коагуляции коллоидов к вытяжке добавлено 50 мл насыщенного раствора H₂SO₄. Общий объем вытяжки составил 250 мл. Для определения содержания общего углерода вытяжки (С_{общ. выт.}) на выпаривание и последующее окисление хромовой смесью взято 20 мл. На титрование холостой пробы пошло 22,5 мл раствора соли Мора, на титрование испытуемого образца пошло 13,0 мл раствора соли Мора. Нормальность раствора соли Мора – 0,198. Общее содержание углерода в вытяжке равно:

Содержание углерода гуминовых кислот С_Гк в % от массы почвы находят по формуле:

,

где V_ос – объем вытяжки, взятый для осаждения гуминовых кислот, мл; V_гк – общий объем раствора гуминовых кислот, мл; V_в – объем раствора гуминовых кислот взятый для выпаривания, мл; остальные обозначения те же, что и в предыдущей формуле.

Пример расчета. Для определения содержания гуминовых кислот взято 50 мл вытяжки, общий объем которой равен 250 мл и добавлено для коагуляции Гк 10 мл 1 н. раствора H₂SO₄. Выпавший осадок гуминовых кислот отфильтрован и растворен в мерную колбу на 100 мл. Из нее взято 20 мл раствора Гк на выпаривание и последующее окисление хромовой смесью. На титрование холостой пробы пошло 22,5 мл 0,198 н. раствора соли Мора, на титрование испытуемого образца пошло 19,8 мл раствора соли Мора. Содержание углерода гуминовых кислот равно:

Содержание углерода фульвокислот в щелочных вытяжках в % от массы почвы определяют по формуле:

С_Фк% = С_{общ. вытяжки} – С_Гк.

Пример расчета. Содержание углерода вытяжки (С_{общ. выт.}) равно 1,41%, содержание углерода гуминовых кислот (С_гк) равно 0,80%. Содержание фульвокислот составило:

С_фк = 1,41 – 0,80 = 0,61%.

Количество гумина в % от массы почвы находят по формуле:

С_гум = С_{общ. почвы} – (∑С_Гк + ∑С_Фк)

Групповой и фракционный состав гумуса выраженный в процентах от общего углерода почвы дает представление о вкладе групп и отдельных фракций гумусовых кислот в ее органическую часть.

Содержание углерода Гк, Фк и их фракций, а также гумина в % от общего углерода почвы находят по формуле:

где С_Гк(Фк) – содержание углерода гумина, Гк и Фк или их фракции в % от массы почвы; С_{общ. почвы} – общее содержание углерода органических соединений в % от массы почвы.

Результаты определения фракционно-группового состава гумуса сводятся в таблицы: рабочую (табл.24) и окончательную (табл.25).

Таблица 24. (Рабочая) Содержание органического углерода в вытяжках

Вариант расчета	Общий С почвы, %	Непосредственная 0,1 н NaOH вытяжка № 1			0,1 н H2SO4 вытяжка Собщ.	0,1 н NaOH вытяжка № 2 после декальцирования			0,02 н NaOH вытяжка № 3
		Собщ	СГк	СФк		Собщ	СГк	СФк	Собщ	СГк	СФк
% от массы почвы	3,44	0,35	0,07	0,28	0,12	1,45	1,11	0,34	0,60	0,29	0,31
% к общему С почвы	100	10,2	2,0	8,2	3,4	42,1	32,2	9,9	17,5	8,5	9,0

Таблица 25. (Окончательная) Состав гумуса южного чернозема

(составляется на основании данных таблицы 24)

Почва, горизонт, глубина, см	Общий С почвы, %	В % от общего С почвы
		Фракции Гк				Фракции Фк					Сумма фракций Гк и Фк	Гумин
		1	2	3	Сумма	1а	1	2	3	Сум- ма
Чернозем южный. Апах 0-20	3,44	2,0	30,4	8,5	40,7	3,4	4,8	5,1	9,0	22,3	63,0	37,0	1,8

Для выполнения анализа необходимы следующие реактивы:

1. 0,1 н. раствор NaOH: 4 г NaOH растворяют в 500 мл дистиллированной воды и доводят объем до 1 л.

2. 0,02 н. раствор NaOH: 0,8 г NaOH растворяют в 500 мл дистиллированной воды и доводят объем до 1 л.

3. 1 н. раствор H₂SO₄: 28 мл концентрированной H₂SO₄ (плотность 1,84) приливают в мерную колбу на 1л с 500 мл дистиллированной воды, перемешивают и доводят дистиллированной водой до метки.

Насыщенный раствор Na₂SO₄: 100 г Na₂SO₄  10 Н₂О помещают в химический стакан на 750 мл и приливают 400 мл дистиллированной воды. Стакан нагревают на водяной бане до полного растворения соли. Раствор отфильтровывают в мерную колбу на 500 мл и доводят водой до метки. При охлаждении часть соли выпадает на дно в виде кристаллов, что и служит признаком насыщения раствора. Остальные реактивы такие же, как и при определении общего углерода по методу И.В. Тюрина.