Техника окраска по Граму в модификации Синёва.

1. На фиксированный препарат наносят 2-3 капли воды и кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной краской генцианвиолет. Окрашивают 1-2 минуты.

2. Снимают бумажку, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту.

3. Сливают раствор Люголя и наливают на препарат спирт с йодом на 30 секунд. Промывают водой.

4. После этого окрашивают мазок водным фуксином в течение 1 минуты.

5. Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют. В результате окраски грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Отношение бактерий к окраске по Граму.

Кокки окрашиваются по Граму положительно, за исключением гонококков и менингококков. Палочки, не образующие спор, грамотрицательны, за исключением палочек дифтерии, туберкулёза и проказы. Палочки, образующие споры (бациллы и клостридии), - грамположительны. Извитые формы (вибрионы и спириллы) грамотрицательны.

Окраска по Цилю-Нильсену.

1. На фиксированный препарат помещают полоску фильтровальной бумаги, наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на горелке до появления пара, не допуская кипения жидкости. Повторяют 3 раза.

2. Снимают бумагу, промывают водой.

3. Погружают 3 раза в 5% раствор серной кислоты.

4. Промывают препарат водой и докрашивают метиленовой синью 5 минут.

5. Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют.

Контрольные вопросы.

Этапы приготовления препарата-мазка. Для чего фиксируют мазок? Способы фиксации мазков. Какие способы окраски называются простыми? Какие красители применяются для окраски бактерий? Какие способы окраски называются сложными, на чём они основаны? Как производится окраска по Граму в модификации Синёва: в какой цвет окрашиваются грамположительные бактерии, почему? В какой цвет окрашиваются грамотрицательные бактерии, почему? Чем обусловлена способность бактерий различно окрашиваться по Граму? Какие бактерии (кокки, палочки, извитые) красятся по Граму положительно и какие отрицательно? Из каких слоёв состоит клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий? Какие бактерии (грамположительные или грамотрицательные) более чувствительны: а) к пенициллину, детергентам, к основным красителям; б) к азидам, окислителям, стрептомицину, переваривающему действию протеаз? Принцип и техника окраски по Цилю-Нильсену. Какие патогенные бактерии являются кислотоустойчивыми?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

1. Представьте себе, что вы окрашиваете по Граму мазок-препарат из смеси грамположительных кокков и грамотрицательных палочек. Напишите или нарисуйте, как будут окрашены те и другие на каждом этапе окраски.

2. Вы окрашиваете по Цилю-Нильсену мазок-препарат из смеси кислотоустойчивых и кислотоподатливых палочек. Напишите или нарисуйте, как будут окрашены те и другие на каждом этапе окраски.

Работа студента на практическом занятии.

1. Приготовьте мазки - препараты из культур стафилококка и кишечной палочки; окрасьте приготовленные мазки простым способом: водным раствором фуксина и метиленовой синью.

2. Опыт окраски по Граму в модификации Синёва.

Цель опыта: определить, имеет ли метод Грама преимущество перед простым методом и в чём оно состоит; определить, в каких случаях целесообразно применение этого метода.

Материалы: стафилококки (грамположительные бактерии) и кишечные палочки (грамотрицательные бактерии).

Ход опыта: приготовить 2 одинаковых мазка из смеси стафилококков и кишечных палочек; один мазок окрасить водным фуксином, другой - по Граму в модификации Синёва. Микроскопировать.

Результат: 2 рисунка и описание их.

Вывод: содержит ответы на вопросы, поставленные в цели опыта.

3. Опыт окраски по Цилю-Нильсену.

Цель опыта: определить имеет ли метод Циля-Нильсена преимущество перед простым методом и в чём оно состоит; определить, в каких случаях целесообразно применение этого метода.

Материалы: 2 одинаковых мазка из смеси туберкулёзной палочки (кислотоустойчивые бактерии) и кишечной палочки (кислотоподатливые бактерии)

Ход опыта: окрасить один мазок простым способом (метиленовой синью), другой - по Цилю-Нильсену. Микроскопировать.

Результат: 2 рисунка и описание их.

Вывод: содержит ответы на вопросы, поставленные в цели опыта.

Занятие 3

Структура бактериальной клетки.

Цель самоподготовки.

После самостоятельного изучения темы студент должен знать структуру бактериальной клетки.

Исходный уровень знаний.

Для усвоения материала темы необходимо вспомнить:

- принципы классификации микроорганизмов;

- основные размеры и формы бактерий;

- назначение сложных методов окраски.

Цель занятия.

1. Отметить различия в строении и химическом составе прокариотов и эукариотов.

2. Усвоить, что сложные методы окраски служат для дифференциации микробов между собой.

3. Ознакомиться с основными методами сложной окраски, применяемыми для выявления структурных элементов бактерий.

План изучения темы.

1. Принципы классификации микроорганизмов. Основные формы бактерий и назначение сложных методов окраски (повторить).

2. Постоянные структурные элементы бактериальной клетки.

3. Непостоянные структурные элементы.

4. Биологическая роль структурных элементов бактериальной клетки, методы их выявления.

После изучения темы студент должен уметь.

1. Выявлять структурные элементы бактериальной клетки.

2. Дифференцировать микроорганизмы в зависимости от наличия или отсутствия структурных элементов.

Дополнительный материал к занятию.

Микроскопия «раздавленной» и «висячей» капли.

Поднять конденсор до уровня предметного столика и, глядя на верхнюю поверхность конденсора, осветить поле зрения. Слегка опустить конденсор, установить объектив на x40. Поместить препарат на предметный столик. Под контролем глаза, внимательно, глядя сбоку, опустить макровинтом тубус так, чтобы объектив оказался как можно ближе к покровному стеклу препарата, но не соприкасался с ним. Глядя в окуляр, поднимать макровинтом тубус до появления в поле зрения движущихся бактерий. Ни в коем случае не опускать макровинтом тубус, глядя в окуляр.

Микроскопия «висячей» капли отличается от предыдущего способа тем, что сначала надо при малом увеличении x8 отыскать каплю, причём удобнее найти край капли, а потом передвинуть препарат так, чтобы капля заняла всё поле зрения. После этого установить большое увеличение x40 и дальше продолжать так же, как при предыдущем способе.