Дополнительный материал к занятию. Правила микроскопии с иммерсионной системой.

1. Настроить освещение микроскопа, используя вогнутое зеркало и объектив х8. Первоначально освещение настраивают при боковом осмотре верхней линзы конденсора. После этого при наблюдении в окуляр, изменяя положение зеркала, настраивают равномерную освещённость поля зрения.

2. На приготовленный и окрашенный мазок на предметном стекле нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами. Иммерсионное масло можно наносить только на сухой мазок.

3. При помощи револьверного устройства установить иммерсионный объектив с увеличением ´ 90.

4. Осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла.

5. Установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта.

6. Провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может повлечь повреждение стекла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).

7. По окончании работы с микроскопом необходимо вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьверное устройство на объектив с малым увеличением (х8).

Контрольные вопросы.

Перечислите и охарактеризуйте основные этапы развития микробиологии. Назовите основные открытия Л. Пастера, Р. Коха, И.И. Мечникова. Заслуги отечественных учёных в развитии микробиологии. Назовите отрасли микробиологии, разделы медицинской микробиологии. Значение микробиологии в работе провизора. Положение микроорганизмов среди других живых существ. Перечислите основные группы микроорганизмов. По каким признакам отличаются между собой эукариоты и прокариоты? Основные формы бактерий. Как называется кокки, располагающиеся: попарно, цепочкой, гроздьями, по четыре, пакетами? Как называются палочки, образующие споры? Как называются палочки, не образующие споры? Как называются извитые формы с одним завитком спирали? Как называются извитые формы с несколькими завитками? Методы исследования в микробиологии. Микроскопический метод: что изучает, с помощью чего? Устройство светового микроскопа. Что такое иммерсионная система? Правила работы с иммерсионной системой. Что такое разрешающая способность микроскопа и чему она равна у микроскопа с иммерсионной системой? Какова роль иммерсионного масла? Каким свойством должно обладать иммерсионное масло? Куда помещают иммерсионное масло при микроскопии? Нужно ли применять иммерсионное масло при микроскопии с объективом: x8, x40, x90?

Работа студента на практическом занятии.

1. Промикроскопируйте и зарисуйте мазки - препараты различных форм бактерий: круглые (стафилококк, сарцина, стрептококк), палочковидные (кишечная палочка, стрептобациллы), извитые (вибрионы). К рисункам сделайте подписи: название бактерии, способ окраски, увеличение микроскопа.

2. Начертите в тетради таблицу: «Место микробов среди других живых существ».

Занятие 2

Простые и сложные методы окраски.

Цель самоподготовки.

После самостоятельного изучения темы студент должен знать принцип и технику приготовления фиксированных микропрепаратов, простых и сложных методов окраски.

Исходный уровень знаний.

Для усвоения материала темы необходимо вспомнить основные формы бактерий.

Цель занятия.

1. Научиться готовить микропрепараты бактерий и окрашивать их простым методом.

2. Усвоить, что сложные методы окраски служат для дифференциации микробов между собой

3. Освоить метод окраски бактерий по Граму в модификации Синёва и по Цилю-Нильсену.

План изучения темы.

1. Техника приготовления препарата-мазка.

2. Принцип и техника простых способов окраски.

3. Принцип и техника окраски по Граму в модификации Синёва.

4. Принцип и техника окраски по Цилю-Нильсену.

После изучения темы студент должен уметь.

1. Готовить фиксированные препараты из культур микроорганизмов, растущих на плотных питательных средах.

2. Окрашивать препараты методами Грама (в модификации Синёва) и Циля-Нильсена.

3. Дифференцировать микроорганизмы по морфологическим, тинкториальным свойствам и интерпретировать полученные результаты.

Дополнительный материал к занятию.

Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов.

Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает: 1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.

Приготовление мазка. При приготовлении мазка из культуры микроорганизмов, выросшей на поверхности плотной питательной среды, на обезжиренное предметное стекло наносят петлёй небольшую каплю физиологического раствора, располагая её в центре круга, нарисованного с обратной стороны карандашом по стеклу. При работе спиртовка должна находиться прямо перед Вами, на удобном для работы расстоянии. Предметное стекло должно находиться в чашке Петри или лотке: категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! В правую руку берут бактериологическую петлю, в левую - пробирку с культурой. Петлю стерилизуют, внося её в пламя горелки в вертикальном положении. После того как петля накалится докрасна, проводят конец петледержателя через пламя. После этого из пробирки вынимают пробку, удерживая её мизинцем правой руки. После обжигания на спиртовке края пробирки в неё вносят петлю, которую охлаждают, прикасаясь к стенкам пробирки. Затем петлёй с поверхности среды снимают небольшое количество культуры. Не касаясь стенок пробирки, вынимают петлю и закрывают пробирку пробкой над спиртовкой. После этого пробирку с культурой помещают в штатив, а культуру на петле вносят в приготовленную заранее каплю физиологического раствора, хорошо размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого круга или овала 1–1,5 см в диаметре. По окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют в пламени спиртовки.

Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло наносят 1–2 петли исследуемого материала, стерилизуя петлю перед каждым погружением в бульонную культуру микроорганизма, как описано выше, и равномерно распределяют по стеклу (в этом случае не требуется предварительного нанесения на стекло физиологического раствора).

Высушивание мазка. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращённым кверху, можно подержать в струе тёплого воздуха высоко над пламенем спиртовки, не внося препарат в пламя.

Фиксация мазка. Для этого используют физический и химический методы. Физический метод заключается в фиксации мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх (троекратно по 1 секунде). Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок, так как при перегревании могут произойти необратимые изменения в клетке. Химический метод фиксации является более мягким по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (эквивалентное соотношение этанола и эфира), метанол, формалин. После фиксации мазок можно окрашивать.

Окраска мазка. Для окраски мазка следуют предписаниям для каждой методики окраски. При окраске простым способом на мазок наносят несколько капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт им. Краситель оставляют на определённое время. Затем препарат промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.