Самостоятельная работа студентов

Работа № 1. Пробы коллоидоустойчивости белков сыворотки крови.

А. Тимоловая проба

Принцип метода. Метод основан на образовании плохо растворимого глобулино-тимололипидного комплекса при взаимодействии сыворотки крови с тимоло-вероналовым буфером.

Ход работы. К 6 мл тимоло-вероналового буфера (рН 7,6) прибавить 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови и через 30 минут отколориметрировать при красном светофильтре в кюветах толщиной 10 мл против тимоло-вероналового буфера. Расчет произвести по калибровочному графику.

В норме интенсивность помутнения колеблется в пределах от 0 до 4 условных единиц.

Б. Проба Вельтмана

Принцип метода. Метод основан на нарушении коллоидоустойчивости белков сыворотки крови в присутствии раствора хлористого кальция при нагревании.

Ход работы. К 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови прилить 4,9 мл воды, перемешать и нагреть над пламенем спиртовки до однократного закипания пробы. Охладить смесь и посмотреть ее содержимое на свет. Если в пробирке нет единичных хлопьев коагулированного белка, добавить еще 0,1 мл 0,5% раствора хлористого кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторять до тех пор, пока не выпадут хлопья.

В норме коагуляции наступает при добавлении 0,4 - 0,5 мл раствора хлористого кальция.

Клинико-диагностическое. Осадочные пробы широко распространены в клинической практике. Данная группа проб основана на исследовании изменений коллоидной устойчивости белков сыворотки крови при патологических состояниях, сопровождающихся диспротеинемией (воспалительные заболевания, заболевания печени и почек и др.). Лабильность сывороточных белков, определяемая в первую очередь соотношением крупно- и мелкодисперсных фракций (альбумины/глобулины) и снижением коллоидоустойчивости при действии различных денатурирующих агентов, может быть связана с относительным увеличением глобулинов при уменьшении альбуминов. Большое значение имеет и относительное увеличение γ-глобулинов в глобулиновой фракции.

Работа № 2. Количественное определение активности альдолазы в сыворотке крови (метод Брунса в модификации Е.Н. Валуйской и В.И. Товарницкого).

Принцип метода. Альдолаза расщепляет фруктозо-1,6-дифосфат, продукты расщепления которого образуют с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде соединения, окрашенное в малиной цвет. Фруктозо-1,6-дифосфат инкубируется в буферном растворе с исследуемой пробой и гидразинсульфатом для связывания образующихся фосфотриоз. Белки осаждаются трихлоруксусной кислотой и в фильтрате фотометрически определяется окрашенное производное фосфотриоз. Интенсивность окраски пропорциональна активности альдолазы.

Ход работы. В центрифужную пробирку поместить 0,5 мл исследуемой сыворотки крови, 0,5 мл 0,5 % раствора NaHCO₃, 0,12 мл гидразинсульфата, 0,12 мл 0,002 М раствора монойодуксусной кислоты, 0,12 мл дистиллированной воды и 0,12 мл раствора фруктозо-1,6-дисфосфата. Смесь в пробирке перемешеть и поместить в термостат на 1 час при 38°С. После этого в пробирку добавить 1,5 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и содержимое пробирки отцентрифугировать 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость 0,5 мл перенести в чистую пробирку, добавить в нее 0,5 мл 3 % раствора NаОН и оставить на 10 мин при комнатной температуре. После этого добавить 0,5 мл 0,1 % раствора 2,4-динитрофенилгидразина и поставить в термостат при 38°С. По истечении 10 мин к содержимому пробирки добавить 3,5 мл 3% раствора NаОН и колориметрировать на ФЭКе в кювете толщиной 5 мм с зеленым светофильтром против воды.

Расчет. Активность альдолазы сыворотки крови выражают в условных единицах экстинкции, умноженных на 100.

В норме активность альдолазы в сыворотке крови составляет 3-13 единиц и выше.

Клинико-диагностическое значение. Активность альдолазы в сыворотке крови увеличивается при инфекционном гепатите, токсических поражениях печени и некоторых других заболеваниях.

Работа № 3. Определение активности фруктозо-1-фосфаталь-долазы.

Принцип метода основан на связывании фосфотриоз, образующихся после расщепления ферментом фруктозо-1-фосфата, гидразином, с последующим определением триоз, освобождающихся при щелочном гидролизе продуктов динитрофенилгидразиновой реакции.

Ход работы. В пробирку внести 1 мл сыворотки крови и 0,5 мл субстратного раствора (100 мл бариевой соли фруктозо-1-фосфата растворить в 180 мл дистиллированной воды, прибавить 82 мл гидразин-гидрохлорида и довести рН до 7,4, добавляя 0,75н. NаОН, прилить веронал-мединаловой буфер рН 7,4 до конечного объема 400 мл).

В контрольную пробирку внести 1 мл сыворотки крови. Инкубировать в термостате контрольную и опытную пробу 30 мин при 37°С. После инкубации в контрольную пробирку добавить 0,5 мл субстратного раствора. Остальные реактивы приливать в обе пробирки одновременно. Для дефосфорилирования образовавшейся фосфотриозы прибавить по 1 мл 0,75 н NаОН и оставить при комнатной температуре на 30 мин. Добавить по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина 0,1 % раствора в 2 н НСI (500 мл 2,4-ДНФГ растворяют в 80 мл концентрированной НСI при слабом нагревании и доводят до 500 мл водой) и оставить на 30 мин. Затем добавить по 3 мл 0,75 н NаОН и через 5 минут опытную пробу колориметрировать на ФЭКе при зеленом светофильтре против контроля.

Расчет. Количество образовавшихся триоз определить по стандартной кривой, построенной по диоксиацетону. Активность фермента рассчитать по формуле А=а/Т, где А – активность фермента (мкмоль) в 1 мл сыворотки за 1 мин; а – количество образовавшихся триоз, рассчитанное по стандартной калибровочной кривой; Т – время инкубации (мин).

Клинико-диагностическое значение. Активность альдолазы в сыворотке крови увеличивается при инфекционном гепатите, токсических поражениях печени и некоторых других заболеваниях.

Работа №4. Количественное определение активности каталазы крови методом А.Н. Баха и С.Р. Зубковой.

Принцип метода. Метод основан на титровании избытка перекиси водорода, нерасщепленного каталазой, перманганатом калия в кислой среде.

5Н₂О₂ + 2КМnО₄ + 3Н₂SО₄ → 8Н₂О + 5О₂ + К₂SО₄ + 2MnSО₄

Активность каталазы выражается каталазным числом, которое представляет собой количество перекиси водорода в миллиграммах, разложенной 1 мл³ крови за 30 минут. Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

Ход работы. С помощью микропипетки берут кровь из пальца человека или хвоста/уха экспериментального животного и готовят гемолизат крови, разводя ее в 1000 раз в мерной колбе (0,1 мл в 100 мл дистиллированной воды).

В 2 колбочки или широкие пробирки отмерить по 7 мл дистиллированной воды и по 2 мл 1% раствора пероксида водорода. В опытную колбу/пробирку прилить 1 мл разведенной в 1000 раз крови. Обе колбы/пробирки – опытную и контрольную – оставить на 30 минут при комнатной температуре. По истечении указанного времени в обе пробы добавить по 3 мл 10 % раствора серной кислоты, которая прекращает действие каталазы. Содержимое опытной и контрольной проб оттитровать 0,1 н раствором перманганата калия до слабо-розового цвета.

Расчет. Допустим, что на титрование опытной пробы пошло 4,5 мл 0,1 н раствора КМnО₄, а контрольной – 12,6 мл 0,1 н раствора КМnО₄. 0,1 н раствора КМnО₄ соответствует 1 мл 0,1 н Н₂О₂, а 1 мл Н₂О₂ соответствует 1,7 мг Н₂О₂. Следовательно, в данном случае каталазное число соответствует: (12,6 – 4,5) × 1,7 = 13,77 единиц.

Показатели нормы. Каталазное число крови у людей колеблется в пределах от 11 до 20 единиц. В клинике чаще используется показатель каталазы, который в норме составляет 2-3×10^-6.

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм кофеина, ацетоновых тел, алкоголя. Активность каталазы в крови снижается при ряде заболеваний: раке, анемии, туберкулезе и др.

Работа № 5. Количественное определение активности пероксидазы крови по методу Н.И. Симаковой.

Принцип метода. Метод основан на окислении индигокармина кислородом, выделяющемся при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазы. Активность фермента измеряется временем, необходимым для окисления индигокармина, который меняет окраску от сине-зеленого в желто-розовый цвет. Чем меньше время окисления, тем выше активность фермента.

Ход работы. В пробирку налить 2 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 4,7, прибавить 3 мл разбавленной в 1000 раз крови (см. работу 2), 2 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,001% раствора индигокармина. Содержимое пробирки тщательно перемешать и быстро внести в нее 2 мл 0,2 % раствора Н₂О₂. В момент внесения Н₂О₂ засечь по секундомеру время и зафиксировать время перехода сине-зеленой окраски в желто-розовую.

Расчет. Пероксидазное действие крови связано с количеством гемоглобина, количество которого у разных людей отличается, поэтому определяется индекс пероксидазной реакции. Это отношение времени окисления индигокармина, к процентному содержанию гемоглобина в крови, умноженное на 100%.

Примерный расчет. Допустим, что переход окрашивания жидкости произошел за 8 секунд, а количество гемоглобина в исследуемой крови составляет 80% (160 г/л гемоглобина принято принимать за 100%); следовательно, индекс пероксидазной активности будет равен:

^{8 сек × 100%} = 10

^80%

В норме пероксидазная активность крови колеблется от 30 до 50 секунд.

Работа № 6. Обнаружение перекисей в растительном масле

При длительном хранении происходит перекисное окисление непредельных жирных кислот в растительном масле. Органические перекиси и гидроперекиси являются сильными окислителями и окисляют соли железа (II0 в соли железа (III). Последние образуют с роданистыми солями хорошо растворимое в воде ярко окрашенное родановое железо.

Ход работы. В пробирку прилить 1 мл свежеприготовленного 2% раствора соли Мора (FeSO₄●(NH₄)SO₄●6H₂O, или двойной железисто-аммонийной сернокислой соли), добавить несколько капель 15 раствора роданистой соли – NH₄CNS или KCNS. Добавить 1 мл исследуемого растительного масла и сильно встряхнуть. Через несколько минут отметить появление окраски в нижнем – водном – слое.

Эталоны ответов на тесты контроля исходного уровня знаний

Вид 1. А) А, В, Г, Д; Б) 1, 2, 3.

Вид 2. А) 1Б, И, К; 2А, В, Г, Д, Е; 3Ж; З; 4Ж,З,Л. Б) 1Б, 2А, 3А, 4Б, 5В, 6А, 7Б.

Вид 3. А) 4; Б) 1, 2, 3, 4, 5.

Вид 4. А) Е (-, -, -); Б) Е (-, -, -).