Основы иммуноферментного анализа

Сущность ИФА, относящегося к иммунохимическим методам, заключается в специфическом взаимодействии антигена и антитела с последующим присоединением к образующемуся комплексу коньюгата – анти-антитела, меченного ферментом. Фермент вызывает превращение неокрашенного субстрата (хромогена) в окрашенный продукт, выявляемый фотометрически. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации комплекса антиген-антитело. В качестве иммобилизованного на поверхности анти-антитела (антивидового иммуноглобулина) фермента чаще используются пероксидазы. При разложении ими Н₂О₂ выделяется кислород, вызывающий окисление хромогена в окрашенный продукт.

Процедура твердофазного ИФА (ELISA - еnzyme-linked immunosorbent assay) включает следующие этапы:

1) специфическое связывание антигена (2), пришитого к твердой фазе (1- планшета) с имеющимся в сыворотке антителом(3);

2) образование коньюгата – присоединение анти-антител, меченных ферментом (4);

3)сопряженное с энзиматической реакцией образование окрашенного продукта

Клинико-диагностическое значение ифа

ИФА широко используется в клинике с целью:

1. диагностики инфекционных и паразитарных заболеваний;

2. количественного определения гормонов и других биологически активных соединений;

3. диагностика ранних сроков беременности;

4. выявление онкомаркеров.

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Один наиболее верный ответ.

1.1. Молярная активность (число оборотов) выражается в … .

а) моль/мг мин б) моль/сек в) кат/ г-моль г) моль/кг сек

1.2. Мультиэнзимные комплексы представляют собой … .

а) надмолекулярные структуры

б) иммобилизованные ферменты

в) олигомерные белки

г) множественные формы ферментов

Вид 2. Установите соответствие.

2.1. Наследственное заболевание – дефектный фермент

1. фенилкетонурия а) глюкозо-6-фосфатаза

2. алкаптонурия б) тирозиназа

3. болезнь Гирке в) фенилаланингидроксилаза

4. галактоземия г) гомогентезиназа

5. альбинизм д) галактокиназа

2.2. Единицы измерения активности ферментов

1. число оборотов а) кат/г-моль

2. катал б) мкмоль/мин

3. международные единицы в) моль/сек

2.3. Заболевание – индикаторный фермент.

1. острый панкреатит а) ЛДГ(изоферменты)

2. вирусный гепатит б) аминотрансферазы

3. заболевания костей в) креатинкиназа (изоферменты)

4. механическая желтуха г) щелочная фосфатаза (изоферменты)

5. рак предстательной железы д) кислая фосфатаза

6. инфаркт миокарда е) α-амилаза

Вид 3.Правильное сочетание ответов.

3.1. Преимущества иммобилизованных ферментов:

1. имеют большую специфичность к субстрату

2. отличаются большей активностью

3. отличаются механизмом катализа

4. имеют большую стабильность

5. не могут использоваться многократно

3.2. Изоферменты лактатдегидрогеназы отличаются …

1. субъединичным составом

2. тканевой локализацией

3. электрофоретической подвижностью

4. внутриклеточной локализацией

5. катализируемой реакцией

Вид 4.Определите правильность утверждений в предложении и

установите наличие причинной связи между ними.

4.1. Определение активности ферментов необходимо производить при полном насыщении фермента субстратом - при Кm>[S], поскольку именно в этих условиях скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента.

4.2. При электрофорезе в полиакриламидном геле изофермент ЛДГ ₁первым мигрирует к аноду, поскольку состоит из 4-х М-субъедниц, обладающих наибольшим отрицательным зарядом.