2. Циклогексимид

При добавлении циклогексимида, специфически подавляющего синтез белков в клетках животных, через 2 ч после заражения вирусом гриппа образование вРНК немедленно прекращается, тогда 1как образование вжРНК все еще продолжается по крайней мере в течение 2 ч (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Пока неизвестно, необходим ли непрерывный синтез вирусного 'или 'Клеточного 'белка, используемого в 'Качестве /кофактора для полимеразы, синтезирующей вРНК, или необходим некоторый 'белок (например, NP-белок) для стабилизации вновь синтезированной вРНК, или подавление синтеза определенного вирусного 'белка приводит к непрерывному образованию вкРНК, синтез которой в норме выключается через 3 ч после заражения. Это выключение может ■быть необходимо для запуска синтеза вРНК- Исследования с темпер атурочуветвительными мутантами должны ответить на некоторые из этих вопросов.

Опыты Bean и Simpson (1973) показали, что первичная транскрипция in vivo (синтез вкРНК на матрице ъРНК с помощью полимеразы инфицирующей частицы) не подавляется циклогексимидом, тогда ка,к актиномицин D подавляет транскрипцию полностью. Таким образом, циклогексимид не воздействует in vivo на активность полимеразы, вводимую с инфицирующей частицей и синтезирующую вкРНК- Он, однако, подавляет синтез новой полимеразы, необходимой для производства вкРНК.

3. Глюкозамин

Глюкозамин, как известно, истощает пул УТФ в клетках куриного эмбриона путем образования УТФ-]М-ацетилглкжо-замина (Scholtissek, 1971). Когда раствор Эрла, содержащий глюкозу, используется в качестве жультуральной среды, он

оказывает влияние только на синтез вирусных глнкопротеи-нов (см. раздел V). Если, однако, глюкозу как источник энергии заменить лируватом или фукозой, то истощение пула УТФ этими аминосахарами происходит примерно в 10 раз активнее. При этих условиях пул УТФ клетки-хозяина становится специфическим ограничителем акорости синтеза вРНК, тогда как синтез (клеточной РНК еще не затрагивается (Scholtissek, 1975). В результате подавления синтеза вирусной РНК отсутствует и образование вирусных белков.

Эти данные могут быть интерпретированы двояко: или вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза имеет низкое сродство к УТФ по сравнению с клеточными ДНК-зависимым'и РИК-полимеразами, или в клетке существуют два более или менее независимых пула УТФ, один из которых может 'быть использован для синтеза вирусной РНК и испытывает большее воздействие со стороны глюкозамина, чем другой пул, который может использоваться в качестве субстрата РНК-по-лимеразами «летки.

Г. СИНТЕЗ ВИРУСНОЙ РНК IN VITRO

В клетках, зараженных вирусом гриппа, несколькими исследователями обнаружена РНК-зависимая РНК-полимераза (Но, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970; Compans, Cali-guiri, 1973). Большая часть активности фермента обнаружена в микросомальной фракции зараженных клеток. В системе in vitro эта активность снимается РНК-азой, но не ДНК-азой. Это значит, что внутренней матрицей является РНК- Реакция требует присутствия всех четырех нуклеозидтрифосфатов и чувствительна к актином-ицину D. Большая часть продукции реакции in vitro имеет низкую относительную молекулярную массу. Данные Horisberger и Guskey (1973) предполагают, что в цитоплазме присутствуют две различные активности ферментд: одна является М§++-завиеимой и подавляется относительно высокими концентрациями солей, другая — Мп++-зависима и более резистентна к солям. Последняя активность фермента обнаруживается также внутри вирусной частицы (см. гл. 5).

Относительно продукта цитоллазматического фермента в системе in vitro получены противоречивые результаты. Ruck ■и соавт. (1969) сообщили, что в их руках этот фермент синтезирует по крайней мере 'некоторые из РНК вирионного типа (от 14 до 19S). Авторы пришли ;к такому заключению при определении состава оснований продукта в системе in vitro после инкубации микросомальной фракции со всеми четырьмя [3Н] -меченными нуклеозидтрифосфатами известной удельной радиоактивности. Однако данные по изучению ближайших

к адениловой кислоте соседей, лолученные в той же работе с использованием ,[(а-32Р] АТФ, согласуются с данными анализа ближайших соседей, .полученными Scholtissek (1969), в результате чего был сделан вывод о том, что продукт в системе in vitro обладает структурой вкРНК. Mahy и Bromley (1970) в своей первоначальной публикации также заявили, что некоторая часть продукта в системе in vitro, полученного с помощью цитоплазматического фермента, должна 'быть вРНК. Однако недавно Hastie и Mahy (1973) при анализе ближайших соседей и специфической гибридизации подтвердили образование цитоплазматическим ферментом почти исключительно вкРНК, как это было впервые показано Scholtissek (1969). Caliguiri и Compans (1973) также выделяли РНК-по-лимеразу из цитоплазмы клеток, зараженных вирусом гриппа, которая в системе in vitro синтезировала РНК, не менее 90% которой имеет последовательность оснований, комплементарную чвРНК. Hastie и Mahy (1973) «ашли, что значительный процент продукта в системе in vitro, синтезируемого ядерным ферментом в присутствии актиномицина D, не -был способен пибридизоватьея с немеченой вРНК- Пока неясно, какого типа РНК не способна к такой гибридизация. Очень малая часть РНК, синтезируемой при этих условиях, гибри-дизуется с немеченой акРНК (Scholtissek, неопубликованные данные).

Кинетика включения меченого ГТФ в вирусную РНК может быть интерпретирована как свидетельствующая о том, что реинициация синтеза РНК в системе in vitro отсутствует. Если неочищенный препарат фермента инкубируют при низких концентрациях солей, почти вся вновь синтезированная РНК изначально является однонитчатой. Однако после экстракции фенолом 'большой процент РНК становится РНК-азорезистентным. Фенол переводит промежуточную реплика-тивную структуру,, состоящую из однонитчатой матрицы и вновь синтезированной вкРНК, удерживаемых друг с другом в месте репликации молекулой' полимеразы, в частично дву-нитчатую структуру (Feix et al., 1967; Oberg, Philipson, 1971). Эти данные о продукте фермента вируса гриппа в системе in vitro можно интерпретировать таким образом, что полимераза не только инициирует и продолжает полимеризацию, но она отделяет вновь синтезированную цепь от своей матрицы. В противном случае образуется двунитчатая структура РНК, которая не обладает 'биологическими функциями (Paffenholz, Scholtissek, 1973). Если инкубация проводится при высокой концентрации солей или с очищенным ферментом, большой процент продукта уже является двунитчатой РНК до экстракции фенолом (Schwartz, Scholtissek, 1973).

Это свойство РНК-нолимеразы вируса гриппа синтезировать исключительно вкРНК в системе in vitro -было исполь-

.зовано для установления генетического родства различных штаммов вируса гриппа по определению гомологии в последовательности оснований между ними (Scholtissek, Rott, 1969b; Hobson, Scholtissek, 1970; Anschutz et al., 1972).