2. Гемадсорбция

В связи с тем что вирионы триппа отделяются от клетокпутем отпочкования, вирусный гемагглютинин, локализованный на поверхности инфицированных клеток, может быть обнаружен до сформирования вирусных частиц. Титр вируса можно рассчитать с помощью: а) метода, основанного на связывании эритроцитов с кленками путем определения конечной точки титрования (Shelokov, 1958); б) подсчета центров в монослое клеток, покрытых адсорбированными эритроцитами (Hotchin et al., 1960); в) отделения фракции клеток с адсорбированными на них эритроцитами (White et al., 1965); г) определения количества гемоглобина в эритроцитах, адсорбированных на инфицированных клетках (Finter, 1964). Последние две методики не требуют, чтобы в инфицированных клетках впоследствии синтезировались полноценные вирусные частицы! Эти методики использовали для обнаружения гемагглютинина на поверхности клеток HeLa при абортивной инфекции, вызываемой вирусами гриппа (Wong, Kilbourne, 1961; White et al., 1965), и для обнаружения синтеза гемагглютинина температур©чувствительных мутантов при непермиссивных температурах (Mackenzie, Dimmock, 1973).

3. Ингибирование гемагглютинации

Реакция гемагглютинации ингибируется как антителами, специфическими для вирусного гемагглютинина, так и рядом растворимых гликопротеидов, обнаруживаемых в сыворотке .крови и других жидких субстанциях организма. Торможение гемагглютинации, обусловленное либо специфическими антителами, либо неспецифическими веществами, выражается количественно с помощью метода, основанного на смешивании стандартного количества вирусных частиц с кратными разведениями исследуемой сыворотки и последующим добавлением в систему эритроцитов, и расчетом титра ингибитора по наибольшему разбавлению сыворотки, полностью подавляющей гемагглютинацию. Неспецифические ингибиторы гемагглютинации, присутствующие в разных концентрациях в большинстве сывороток, необходимо удалить или разрушить перед определением количества специфических антител. Для этой цели обычно используют нагревание, обработку нейраминидазой, трипсином или перйодатом. Неспецифические ингибиторы можно удалять с помощью ионообменников (Kilbourne et al., 1972b). Поскольку все указанные виды обработки могут, кроме того, снизить концентрацию специфических антител, используемый метод предварительно должен быть проверен на уже исследованном штамме вирусов и изученном типе сыворотки.

Г. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ ГРИППА С НЕСПЕЦИФИЧЕСКММИ ИНГИБИТОРАМИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Хотя присутствие в сыворотке неспецифических ингибиторов и создает дополнительные трудности при определении количества специфических антител, тем не менее их свойство блокировать гемагглютинацию можно использовать для изучения механизма взаимодействия вирусов с эритроцитами. Неспецифические ингибиторы разделяются по своему химическому составу и свойствам на α-, β- и γ-ингибиторы (Krizanova, Rathova, 1969). Один из них — α-ингибитор, или «ингибитор Фрэнсиса» (Francis, 1947), охарактеризован наиболее полно. Он представляет собой содержащий сиаловую кислоту гликопротеид, который ингибирует гемагглютинацию, но не влияет на инфекционный процесс. Его активность резко снижается при обработке нейраминидазой, но не исчезает после прогревания при 56 ЧС в течение 30 мин. Ингибитор β-типа, или «ингибитор Чу» (Chu, 1951), вероятно, не содержит остатков сиаловых кислот; он инактивируется нагреванием при 56°С в течение 30 мин, но не теряет свою активность при обработке нейраминидазой.

Различаются ли ингибиторы α- и γ-типов настолько, чтобы оправданно относить их к разным классам, является предметом дискуссии (Kjlbourne et al., 1972b). Согласно классификации, предложенной Krizanova и Rathova (1969), ингибиторы α-типа в отличие от γ-ингибиторов инактивируются нейраминидазой. Однако обработка нейраминидазой может полностью снизить активность данного ингибитора для одного штамма вируса без изменения его активности для другого штамма. Кроме того, данный гликопротеид может ингибировать гемагглютинирующую активность двух вирусных штаммов и снижать инфекционность только одного из них. Таким образом, к какому типу отнести обнаруживаемый ингибитор, частично зависит от штамма используемого для определения активности ингибитора вируса. В связи с тем что в таких исследованиях использовали большое число различных штаммов вирусов, вопрос о различиях между α и γ-ингибиторами в настоящее время является в некоторой степени спорным. Choppin (Kjlbourne et al., 1972) предложил, чтобы ингибиторы характеризовались по источнику выделения и по различиям в химических и физических свойствах (если эти различия известны), а не по типам ингибирования, наблюдаемого для данного штамма вируса.

Большая путаница в настоящее время существует в вопросе о роли ингибиторов в нейтрализации вируса. Поскольку предполагается, что рецепторы на поверхности клетки-хозяина и эритроцитов одинаковы то составу, ингибиторы гемагглютинации должны также снижать инфекционность вируса. Вирионы с присоединенными ж ним молекулами «-ингибитора не должны адсорбироваться на центры мембраны клетки-хозяина, содержащие в своем составе сиаловые кислоты, за счет зарядового отталкивания и стерических эффектов. Однако, поскольку известно, что вирионы гриппа инфекционны в присутствии α-ингибитора, было предположено, что адсорбция вирусов осуществляется уже после того, как вирионная нейраминидаза разрушит комплекс между вирусной частицей и молекулой ингибитора (Kjrizanovs, Rathova, 1969). Можно было бы ожидать, что, если ингибиторы а-тина и будут снижать инфекционность вирусов гриппа, это будет справедливо для штаммов с низкой нейраминидазной активностью. Как описано в тл. 4, инфекционность вирионов, не обладающих регистрируемой нейраминидазной активностью, увеличивается под действием по крайней мере одного ингибитора гемагглютинации, содержащего сиаловые кислоты. Поэтому не активность нейраминидазы, а, вероятно, какое-то другое свойство вирионов ответственно за те различия, которые наблюдаются при их контакте с эритроцитами и клеткой-хозяином. Наши попытки изучить рецепторы клетки-хозяина, используя ингибиторы гемагглютинации, могут быть сходны с нахождением правильного решения при собирании разорванной картинки при условии, что мы не знаем, все ли имеющиеся фрагменты должны быть использованы для получения законченного изображения. В действительности, по-видимому, мы уже поставили некоторые фрагменты картинки в неправильное положение. Например, мы, вероятно, не должны рассматривать остатки сиаловой кислоты как существенную часть структуры клеточных рецепторов до тех пор, пока не попытаемся использовать для изучения необходимых условий адсорбции вируса не эритроциты, а саму клетку-хозяина.