- •I. Введение. Грипп — заболевание с неизменяющейся симптоматикой, вызываемое изменяющимся вирусом
- •II. Таксономия вирусов гриппа
- •IV. Структурное и функциональное родство вирусов гриппа с другими рнк-содержащими вирусами
- •V. Антигенная изменчивость вируса гриппа и ее отличие от антигенной изменчивости других инфекционных агентов
- •VI. Нерешенные вопросы
- •Структура вируса гриппа
- •I. Введение
- •1. Число и функции полипептидов
- •4. Нейраминидаза
- •5.Белок нуклеокапсида
- •7. Количество полипептидов в вирионе
- •8. Вирусы гриппа в и с
- •1. Гемагглютинин
- •2. Нейраминидаза
- •IV. Сборка вирионов
- •V. Заключение. Модель вириона гриппа
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин
- •II. Реакция гемагглютинации
- •1. Количественное определение гемагглютинации
- •2. Гемадсорбция
- •3. Ингибирование гемагглютинации
- •III. Структура гемагглютинина
- •1. Химический состав изолированных гликопептидов
- •2. Антигенные свойства гликопептида hAt
- •4. Структура субъединицы на
- •5. Антигенная гомогенность субъединиц на
- •1. Моновалентный гемагглютинин
- •2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина
- •IV. Функции гемагглютинина
- •V. Заключение
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза
- •II. Специфичность нейраминидазы
- •III. Субстраты для нейраминидазы
- •IV. Химические свойства нейраминидазы
- •V. Содержание нейраминидазы в оболочке вируса
- •1. Использование протеолитических ферментов
- •2. Использование детергентов
- •VI. Свойства изолированной нейраминидазы а. Состав аминокислот
- •VII. Структура нейраминидазы
- •VIII. Антигенные свойства нейраминидазы
- •IX. Лектины и нейраминидазы
- •X. Ингибиторы активности нейраминидазы
- •XI. Роль нейраминидазы
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа
- •I. Введение
- •II. Активность рнк-полимеразы в инфицированных клетках
- •IV. Заключение
- •Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
- •I. Введение
- •II. Методы
- •1. Экстракция рнк из вирионов
- •1. Анализ экстрагированной рнк с помощью градиентного центрифугирования
- •2. Анализ экстрагированной рнк с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (паагэ)
- •IV. Комплекс рнк с белком (рнп) а. Физические и химические свойства
- •2, Созревание и упаковка рнк в вирионы
- •1. Внутриклеточная локализация вкРнк
- •2. Кинетика синтеза вкРнк
- •3. Физические свойства информационной рнк (мРнк)
- •VI. Действие ингибиторов на синтез рнк
- •VII. Заключение
- •Генетика вируса гриппа
- •I. Введение. Исторический обзор
- •1. Исследования по генетике, проведенные Burnet и сотрудниками
- •2. Исследования по генетике, проведенные Hirst и Gotlieb
- •II. Геном вируса гриппа
- •III. Мутации, изменчивость, адаптация
- •1. Модификация вирусных гликопротеидов
- •2. Модификация вирусной оболочки
- •3„ Модификации с помощью протеолитических ферментов
- •1964) Или к гуанидвнгидрохлориду (David-West, 1973) явля
- •2. Фенотипы, относящиеся к нейраминидазе
- •3. Морфология вириона
- •1. Чувствительность к клетке-хозяину
- •2. Патогенность
- •3. Механизм рекомбинации
- •10% От выхода вируса при разрешающей температуре. Шля1
- •V!. Фенотипическое смешение и гетерозигозис
- •VII. Изучение функции генов с помощью ts-мутантов
- •VIII. Заключение
- •Репликация вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Адсорбция, проникновение, «раздевание» вируса
- •III. Транскрипция а. Последовательность синтеза рнк
- •2. Циклогексимид
- •3. Глюкозамин
- •IV. Синтез вирусных белков
- •2. Белок нуклеокапсида
- •3. Неструктурные белки
- •4. Мембранный м-белок
- •5. Гемагглютинин
- •VI. Синтез липидов
- •VII. Сборка (см. Также гл. 2)
- •IX. Неправильные формы размножения
- •Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинического материала
- •I. Введение
- •II. Культивирование вирусов в лабораторных условиях
- •1. Продуктивная инфекция
- •2. Абортивная инфекция
- •3. Персистентная инфекция
- •4. Параметры инфекции
- •IV. Выделение вируса
- •Антигенная изменчивость вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Грипп в историческом аспекте (см. Также гл. 15)
- •III. Свойства генома вируса гриппа
- •IV. Субъединицы гемагглютинина
- •V. Механизм антигенного дрейфа
- •1955, 1956; Magill, 1955; Hamre et al., 1958). Эпидемиологиче
- •1956, 1957; Takatsy, Furesz, 1957), антигены постепенно за
- •VI. Механизм антигенных сдвигов (значительных антигенных изменении)
- •VII. Дополнительные доказательства,
- •2. Естественная передача вируса и селекция
- •3. Селекция и передача «нового» вируса гриппа в системе in vivo
- •1. Антигенные соотношения между вирусами гриппа человека, низших млекопитающих и птиц
- •2. Круг хозяев
- •Иммунология гриппа
- •I. Введение
- •II. Проявления иммунитета
- •1. Устойчивость к инфекции
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •4. Механизм действия антител к na
- •V. Влияние антигенного дрейфа на иммунитет
- •VII. «первородный антигенный грех»
- •VIII. Клеточный иммунитет и грипп
- •IX. Заключение
- •Грипп у человека
- •2. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа а
- •3. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа в
- •7. Изменения бактериальной флоры
- •8. Функция легких при неосложненном гриппе
- •9. Выделение больными вируса в окружающую среду
- •10. Интерферон
- •11. Продукция антител
- •1. Пневмония
- •2. Острые заболевания нижних дыхательных путей у детей
- •3. Обострение хронического бронхита
- •III. Экспериментальная гриппозная инфекция у человека
- •3. Продукция интерферона при заболевании
- •IV. Выводы и заключение
2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина
Как было указано, гемагглюти'нация имеется только при наличии мультивалентных молекул, которые могут быть сформированы in vitro в там случае, если НА2-часть субъединицы интактна. Такие агрегаты показаны на 34 (см. гл. 10). Поскольку они формируются из различного числа «шипов» НА*, агрегаты неодинаковы по размерам.
Процесс диссоциации «шипа» НА* и его агрегации с образованием частиц, вызывающих гемагглютинацию, представлены схематически на 14. «Шип» изображен как тример, причем гидрофобная область каждой из трех субъединиц НА* внедрена в двойной лилидный слой вирусной частицы. Эти гидрофобные области удаляются при изоляции НА* с помощью протеазы (см. 14,А).
Описанная модель основана на экспериментальных данных, полученных для (большого числа вирусных штаммов, однако не все детали схемы осуществляются для каждого отдельного штамма. Например, наблюдаются большие различия в чувствительности разных штаммов вируса к действию протеаз (Schulze, 1973). Протеазы инактивируют и, вероятно, разрушают НА* многих штаммов вируса (Kilbourne, 1969), однако в отношении некоторых из них имеет место протеазная инактивация, действующая не только исключительно яа НА*. Kilbourne и еоавт. показали, что НА-антиген может потерять чувствительность к лротеазе в процессе генетической рекомбинации (Kilbourne et al., 1972a). Эти наблюдения вместе с другими экспериментальными данными показывают, как опасно делать заключение о структурных перестройках на основе наблюдаемых изменений биологической активности. Действительно, описанная модель предполагает, что НА*, изолированный из вирусной частицы с помощью обработки (бромелайном, зде меняет своей структуры за исключением потери гидрофобной области. Однако такой НА*, изолированный из некоторых штаммов вируса, не адсорбируется на эритроцитах (Laver et al., 1974), что указывает на наличие структурных изменений в гидрофильной части субъединицы (в ее НАрчасти). Поскольку эти изменения -мотут быть крайне незначительными, их можно не заметить, если использовать имеющиеся в настоящее время физические методы.
IV. Функции гемагглютинина
Два важных аспекта, связанных с присутствием НА*, были ясны задолго до проведения детального анализа структуры вириона гриппа. После эпидемии гриппа в 1947 г. стало ясно, что поверхностные антигены вириона претерпевают кардинальные изменения своего состава и в связи с этим штаммы вирусов, обладающие одинаковым внутренним антигеном, показывают в перекрестных реакциях нейтрализации и подавления гемагглютинации низкую активность (Francis et al., 1947). Следовательно, было показано, что НА* является основным 'поверхностным антигеном и что он один стимулирует синтез антител, нейтрализующих инфекционность и ингиби-рующих темагглютинацию (Drzeniek et al., 1966; Laver, Kilbourne, 1966). Таким образом, был сделан вывод, что НА* ответствен за прикрепление вируса к клетке-хозяину или к эритроцитам и что изменения именно в его структуре влияют на антигенные свойства вирионов.
Как было показано в разделе III этой главы, некоторые из этих свойств остаются присущими НА* при его отделении от вирусной частицы. Изолированный НА* может адсорбироваться на эритроцитах и, если выполняются условия образования мультивалентных агрегатов, может вызвать гемагглю-тинацию. НА* вызывает образование HI и нейтрализующих
антител, если даже в качестве антигена используются обра
ботанные детергентом молекулы, не обладающие гемагглю-
тинирующей активностью. Эти антитела в очищенном виде
имеют высокую степень антигенной специфичности, так что
штаммовые различия, характерные для интактных вирибнов,
можно успешно исследовать при использовании субъединиц
в качестве антигенов. :
После выяснения структуры вириона гриппа стало также
понятно, почему очищенные вирионы содержат <в своем соста
ве так называемый антиген хозяина. Было 'выяснено, что этот
антиген, обнаруживаемый и в очищенных препаратах вируса
(Knight, 1944; Harboe et al., 1961; Harboe, 1963), является
углеводной частью поверхностных гликопротеидов. Он пред
ставлял собой гликопротеид, лишенный остатков еиаловых
кислот (Hankenes et al., 1966; Laver, Webster, 1966), реаги
ровал с антителами к НА* и блокировал их Ш-активность.
Эти кросс-реакции наблюдаются в связи с тем, что НА* содер
жит олигосахариды, синтезированные ферментами клетки-
хозяина из пула подходящих углеводных остатков, которые
поэтому сходны с олигосахаридами, содержащимися в гли-
копротеидах клетки-хозяина. . . . .
Информация, полученная при использовании в качестве объекта исследования изолированного НА*, была крайне полезна для выяснения структурных взаимоотношений внутри «шипа» НА* и в решении вопроса, какие части «шипа» способны связываться с лииидным двойным слоем, а какие — взаимодействуют с клеточными рецепторами. Однако понимание роли «шипа» НА* в присоединении вирионов к эритроцитам и к хозяйским клеткам возможно только при изучении НА* in 'situ. В связи с этим предпринимались попытки изменить НА*, входящий в состав вириона, для того, чтобы скор-релировать изменение в его структурной организации с изменениями в его свойствах.
16. Влияние присоединения остатков сиаловой кислоты на биологические свойства вируса гриппа. Очищенный вирус штамма A0/WSN инкубировали с ЦМФ-сиаловой кислотой и сиалилтрансферазой. Во время инкубации отбирали аликвоты для определения гемагглютинирующей и нейрами-нидазной активности и инфекционности. Нейрамииидазную активность определяли по скорости отщепления сиаловой кислоты от фетуииа с помощью колориметрического метода Aminoff (1961). Инфекциовность определяли методом подсчета бляшек в моноелюях клеток МДВК (Madin, Diarby, 1958) и фибропластов куриного эмбриона (CEF). Вирусные частицы с отщепленной с помощью трипсина нейраминидазой (ом. табл. 10) инкубировали в тех же условиях и их активность определяли тем же способом. Контроли, содержащие внтактный или трипсинизироваяный вирусы, инкубировали в той же среде за исключением ЦМФ-еваловой кислоты. После инкубации в течение 6 ч при 137 СС контроля обладали 100% гемагглютинирующей активностью и приблизительно 60 и 10% начальной инфекционности и нейраминидазной активности. 'Светлые значки относятся к трипеинизированном'у (вирусу (Schulze, 1975).
Довольно неожиданные биологические последствия .присоединения к гем агглютинину in vitro остатков сиаловой кислоты суммированы на 16. Гемагглютинирующая активность теряется, нейраминидазная активность остается той же, как для инкубированного (Контрольного вируса, а и-нфекцион-ность в значительной степени растет. Степень роста инфекционности зависит от количества присоединенной сиаловой кислоты, от клеток, на которых проводилось определение инфекционности, и от того, был ли вирус предварительно обработан трипсином для удаления его собственной NA*1.
Остатки сиаловой .кислоты, присоединенные ,к интактному вирусу in vitro, могут быть удалены с помощью NA* сиали-зидированных вирионов, если будут созданы оптимальные для работы этого фермента условия (Schulze, 1975a, b). В связи с этим вполне вероятно, что вирусная NA* отщепляет от вирионного НА* остатки сиаловой кислоты, присоединяемые к нему сиалилтраноферазами клетки-хозяина. Доказательства в пользу такого механизма были впервые приведены Palese и соавт. (1974) и будут описаны в гл. 4. Однако ковалентное присоединение сиаловой кислоты к вирусным гликолротеидам или к их предшественнику in vivo еще не было осуществлено.
Механизм увеличения инфекционности гари ковалентном присоединении сиаловой «кислоты [в настоящее время выясняется. Поскольку наблюдаемая степень увеличения инфекционности частично зависит от того, какой тип клеток используется для определения инфекционности, вполне вероятно, что присоединение остатков сиаловой кислоты увеличивает степень связывания вирионов с какими-то клеточными рецепторами. В этой связи интересно отметить, что, по предварительным данным, сиализидированные вирионы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, по-видимому, присоединяются ,к куриным эритроцитам так же, как контрольные вирионы (Schulze, неопубликованные данные). Эти результаты указывают на то, что при некоторых условиях гемагглю-тинация является неточным индикатором наличия взаимодействия вирионов с рецепторами эритроцитов, не говоря уже о взаимодействии их с рецепторами хозяйских клеток.
Аналогичные изменения активности могут быть вызваны с помощью обработки вируса гриппа фетуином — гликопро-теидом, содержащим остатки сиаловой кислоты (Der, Schulze, 1975). Контакт вирионов с фетуином приводит к потере ими гемагглютинирующей активности и увеличивает инфек-ционность препарата (табл. 11). Для предотвращения деструкции ингибитора вирусной нейрамияидазой вирусные образцы обрабатывали трипсином перед инкубацией с фетуином. Обработанные трипсином препараты, не обладающие нейраминидазной активностью, теряли гемаатлютинирующую активность и значительно .увеличивали свою инфекционность после инкубации с фетуином. Удаление остатков сиаловой кислоты с фетуином в большой степени снижало его стимулирующее действие и обработанный фетуин переставал быть ингибитором гемагглютинации. Это указывает на то, что
остатки сиаловой кислоты должны участвовать в изменении обеих активностей. Приведенные результаты показывают, что адсорбция вирионов на клетках-хозяевах может быть облегчена путем добавления некоторых водорастворимых глико-протеидов, содержащих в своем составе остатки сиаловой кислоты. Это увеличение инфекционности, так же как и в случае сиализидированных вирионов, может быть связано с образованием агрегатов, которые являются причиной инфекции, как это наблюдается при агрегатах неполных, но комплементационных вирусных частиц (Hirst, Pons, 1973). Независимо от того, какая из этих альтернатив в действительности имеет место, вероятно, настало время пересмотреть наши взгляды на роль сиалосодержащих гликопротеидов в инфекционном процессе, поскольку некоторые из этих молекул, по-видимому, стимулируют инфекцию вместо ее угнетения.
Вне зависимости от того, какой механизм ответствен за потерю гемагглютинирующей активности и увеличение инфекционности, приведенный выше экспериментальный материал подтверждает тот факт, что присоединение сиаловой кислоты к 1гемагглютинину или взаимодействие вируса с сиа-лосодержащими гликопротеидами приводит к возникновению инфекционных, но не агглютинирующих вирусных частиц. Инфекционные вирусные частицы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, наблюдались ранее в персистентно инфицированных культурах клеток (Gavrilov et al., 1972) в результате химиотерапевтической обработки мышей (Mag-rassi et al., 1966) и в процессе адаптации штаммов вирусов гриппа типа А2 к новым клеткам-хозяевам (Thibon et al., 1967). Поскольку ни в одном из этих случаев вирусные частицы не исследовали после их очистки, механизм ингибиро-вания гемагглютинации пока еще не ясен. Thibon и соавт.
(1967) предположили, что в их опытах гемапглютинин на поверхности вириона присутствовал, поскольку он вызывал синтез HI-антител, но был замаскирован. Ингибиторы же вируса гриппа типа А2 в культуральной среде не обнаруживались.