VII. Структура нейраминидазы

Совершенно точно установлено, что NA* существует на поверхности вириона вируса гриппа в виде палочкообразных выступов. В настоящее время, однако, еще никто не достиг такого разрешения электронного микроскола, которое позволило бы обнаружить различие между «шипами» на вирусной поверхности и однозначно идентифицировать, какие из «шипов» являются NA*, а какие НА*. Laver и Valentine (1969) не смогли идентифицировать «шипы» NA* в связи с большой близостью этих поверхностных структур друг к другу. Как Kendal и Madeley (1970), так и Compans и соавт. (1969) указывают на выявление на поверхности вирионов после их инкубации совместно с антисывороткой к NA* областей, где концентрируются антитела. Следовательно, NA* может быть сосредоточена в локальных участках поверхности вириона. Эти наблюдения, кроме того, подтвердили тот факт, что NA* не локализована только у основания шипов, поскольку антитела прикреплялись к их'внешним концам.

Вне зависимости от того, протеолитичеаким или детергентным методом изолируется NA* из вирионов вируса гриппа, она седиментирует в области 8-—10S и имеет относительную молекулярную массу 200000—250 000. .Кроме того, NA*, изолированная с помощью протеолитических ферментов, имеет немного более низкую скорость седиментации и меньшую молекулярную массу, чем NA*, полученная из вирионов с помощью детергентов. Noll и соавт. (1962) рассчитали, что NA* типа B/Lee, полученная с помощью сояюбилизации трипсином, имеет относительную молекулярную массу 190 000. Эти расчеты основывались на константе седиментации в 9S и парциальном удельном объеме (V), равном 0,7 ом/г. Kendal и соавт. (1968) провели аналогичные расчеты для NA* типа N2, изолированной с .помощью протеазы Нагарсе, и получили молекулярную массу 220 000, принимая константу седиментации равной 8S, a V=0,733 см/г. По данным Wrigley и соавт. (1973), .которые использовали величины V = 0,719 см/г и 9S, .молекулярная масса NA*, выделенной из штамма B/Lee с помощью обработки вирионов трипсином, была равна 207 400. Более высокие константы седиментации были получены для NA*, выделенной с помощью обработки детергентом. Webster и Darlington (1969) нашли эту константу равной 10,8S для NA* типа N2 (Х7) (обработка твином-20), Bucher и Kilbourne (1972) определили величину константы в 11S для NA* типа N2 (Х7), при ее выделении с помощью SDS. При выделении с помощью SDS NA* вируса гриппа типа А имеет константу седиментации, равную 10S, и обработка ее проназой снижает эту константу до 9S (Rott et al., 1970). На основании опытов, проведенных в условиях восстановления, ^предполагалось, что активной формой NA* является тет-рамер (Kendal, Eckert, 1972; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al.,. 1972). Несколько групп исследователей показали, что активные частицы с константой седиментации 10S могут диссоциировать на мономеры относительной молекулярной массой 50 000—60 000 после обработки восстанавливающими агентами, такими, жак меркаптоэтанол и датиотриэтол (Webster, 1970а, b; Skehel, Schild, 1971; Kendal, Eckert, 1972; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972). Твердая уверенность в существовании тетрамерной структуры NA* возникла после публикации Wrigley и соавт. ('1973) их электронно-микроскопических снимков. На них выделенная с помощью про-теолитических ферментов NA* выглядит как планарная тет-рамерная частица, мономер которой представляет собой, скорее образование жубической, чем сферической, формы с длиной ребра около 4 нм (19, см. 35). Если тетрамеры NA* выделяются с помощью SDS, то они сохраняют нитевидные образования, или «хвосты», длиной около 10 нм с утолщением на 'конце диаметром около 4 нм (Laver, Valentine, 1969; Wrigley et al., 1973).

Тетрамерная структура является необходимым условием наличия активности NA* (Bucher, Kilbourne, 1972; Kendal, Eckert, 1972). Gregoriades (1972), проводя опыты по гель-фильтрации в градиенте, обнаружила ферментативную активность меньших, чем тетрамеры, образований. Однако, как ясно из наблюдений Bucher и Kilbourne (1972), в опытах Gregoriades NA* могла реасооциироватье образованием тетрамеров уже после элюции при гель-фильтрации. Хотя после хроматографии на колонке с (биогелем А-5 ('фирма «Bio Red» США), NA* и элюируется в виде частиц с относительной молекулярной массой 53000, фермент способен к спонтанной реассоциации в активные тетрамерные оубъединицы, что 'было показано центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (Bucher, Kilbourne, 1972). Различные уровни ассоциации мономеров с указанием их ферментативной активности приведены на 20.

Хотя дисульфидные связи и играют большую роль в поддержании тетрамерной структуры NA*, ino-видимому, они важны во внутримолекулярных и (или) в междимерных взаимодействиях, а не во взаимодействиях между всеми четырьмя субъединицами (см. 20) (Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972). Bucher и Kilbourne (1972) показали, что диффузия NA* при электрофорезе в полиакриламндном геле без добавления восстанавливающих агентов происходит по

законам, справедливым для молекул с относительной молекулярной массой выше таковой тетрамеров (200 000—250 000). Lazdins и соавт. (1972), проводя эксперимент в невосстанав-лювающих условиях, 'нашли для NA* штамма B/Lee полосу, соответствующую молекулярной массе в 120 000. Для получения мономерных субъединиц ъ этих опытах было необходимо восстановить дисульфидные связи. Авторы этих работ предположили, что мономеры соединены друг с другом в ди-мерных образованиях дисульфидными связями, а связи димеров при формировании тетрамерных структур носят неко-валентный характер.

Хотя тетрамерная структура NA* в настоящее 'время твердо установлена, неясно, формируется ли она четырьмя эквивалентными мономерами (Kendal, Eckert, 1972; Wrigley et al., 1973) или двумя типами неэквивалентных мономеров (Bucher, Kilbourne, 1972). Предполагают, что наличие в молекуле NA* одного или двух типов субъединиц зависит от штамма вируса. То, что NA* имеет булавообразную форму, может означать наличие в ее составе более одного типа макромолекул. Исследователи, изучавшие NA* типа N2, изолированную из рекомбинантных штаммов Х7 и Х7 (F1) с помощью де-тергентного метода, обнаружили два компонента, хотя разные авторы дают различные соотношения между количеством мономерных единиц двух типов (Webster, 1970a; Skehel, Schild, 1971; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972). Bucher и Kilbourne (1972) считают, что мономеры существуют в NA* в эквимолярных количествах; другие авторы показали более низкую .концентрацию для компонента с большей электрофо-ретической подвижностью (Skehel, Schild, 1971; Lazdins et .al., 1972). По данным Kendal и Eckert (1972), в состав NA* реком-бинанта Х7 (F1) входит только один тип полипептида. Следует, однако, отметить, что авторы изолировали фермент с помощью протеолитического метода. Gregoriades (1972) •обнаружила лишь один вид субъединиц для NA* (N1), выделенный из вирионов гриппа штамма WSN. При исследовании .NA*, выделенной из штамма B/Lee, был также обнаружен только один компонент (Lazdins et arl., 1972; Laver, Baker, 1972; Wrigley et al., 1973).

Kendal и Kiley (1973) наблюдали только одну полосу лолипептида при электрофорезе после восстановления NA* Х7 (F1), выделенной из вирионов гриппа протеолитическим методом. Пептидные карты трипсиновых гидролизатов NA*, выделенной иротеолитическим методом, показали наличие только одного типа субъединиц. Такой вывод был сделан на основе подсчета числа радиоактивных сульфгидрильных групп (Kendal, Kiley, 1973). После расщепления трипсином ■субъединиц NA*, меченной 14|С с помощью карбоксиамидоме-тилирования, Kendal и Kiley (1973) наблюдали около 20 пя-

тен при ауторадиографии пептидных карт, что с большой степенью вероятности указывает на присутствие в NA* только одного типа субъединиц, поскольку в них был найден 21 остаток суммарного цистеина. Если бы в NA* существовало два типа субъединиц, то должно было 'бы наблюдаться двойное (42) .количество пятен. Однако Laver и Baker (1972) обнаружили только 14 цистеиновых остатков. Поэтому двойное их количество должно быть равно 28, что в пределах экспериментальной ошибки совпадает с 20 пептидами, обнаруженными Kendal и Kiley (1972) на пептидных жартах. Можно также предположить, что число видов пептидов в NA* может зависеть от метода выделения фермента. Однако пептидные карты'NA*, полученные с помощью обоих методов, не показали существенных различий (Kendal, Bucher, неопубликованные данные).

Lazdins и соавт. (1972) предположили, что в случаях, когда наблюдалось два типа полипептидов, компонента с более высокой электрофорезяой подвижностью подвергалась про-теолизу. Kendal и Kiley (1973) придерживаются такой же точки зрения. Другое возможное объяснение может заключаться в различии углеводной части мономеров. Выяснение вопроса о различии двух типов мономеров NA, действительных или артефактных, связано с разделением и изоляцией этих мономеров. Наличие двух типов субъединиц в NA* увеличило бы трудности при ее генетическом изучении и вместе с. тем возможный потенциал ее генетической изменчивости.