2. Исследования по генетике, проведенные Hirst и Gotlieb

Hirst и Gotlieb (1953) использовали в своих исследованиях только штаммы Mel и WSN. Последний являлся нейро-тропным 'вариантом штамма WS, эквивалентным NWS, «о из другого источника. Смешанные инфекции изучали в аллая-тоисной полости куриных эмбрионов. Далее будут суммированы важнейшие результаты, полученные указанными авторами. Форма XI являлась результатом фенотипического смешения.

Х2: эта форма также подвержена двойной нейтрализации, как и XI, но отличается от XI тем, что при предельных разведениях (наличие одной инфекционной частицы) дает рост потомства, содержащего штаммы Mel и WSN, а, кроме того, иногда еще и Х2. Следовательно, форма Х2 может размножаться по крайней мере в течение нескольких генераций при предельных разведениях без изменения своего характера, но в конце концов может ликвидироваться. Считали, что она является следствием гетерозигозиса или диплоидии.

ХЗ: только один штамм этой формы был получен во всей серии опытов, включающей более 20 пассажей формы Х2. Форма ХЗ, по-видимому, была истинным и стабильным реком-бинантом, который давал продуктивное потомство (в течение по меньшей мере 5 пассажей при предельных инфицирующих разведениях) без увеличения выхода Mel или WSN. Анти-WSN-сыворотка резко тормозила гемагглютинацию ХЗ, но в отличие от XI или Х2 анти-Ме1-сыворотка ингибировала ХЗ слабо, т. е. только при очень больших концентрациях (табл. 20). Отсюда был сделан вывод, что ХЗ несет две ан-

тлгенные специфичности: основной антиген, полученный от штамма WSN, и минорный антиген, полученный от штамма Mel. Ретроспективно представляется вероятным, что ХЗ был реком'бинантом, содержащим НА* штамма WSN и NA* штамма Ме.1; слабое ингибирование анти-Ме1-сывороткой объяснялось стерическим эффектам (см. гл. 12). Нейтрализация ХЗ in ovo анти-Ме1-сывороткой в большей степени, чем ожидалось из ее титра в реакции торможения гемагглютинации, также согласуется с приведенным предположением, поскольку продолжительное присутствие антител, направленных против NA*, может снижать выход вируса до уровня, более низкого, чем тот, который можно определить по гемагглютина-

ции. Это создает видимость большей степени нейтрализации, чем есть в действительности (см. гл. 12).

б) Поведение маркера нейровирулентности. При исследованиях рекомбинации между WSN и Mel авторы использовали только два маркера: наличие или отсутствие нейровирулентности для мышей и серологический тип. Как было обнаружено, рекомбинанты оказались очень асимметричными. В то время 'как рекомбинанты WS-типа, утратившие нейро-вирулентность (W")1, обнаруживались без труда, противоположный тип, т. е. нейровирулентный Mel (M+), не встречался (Hirst, Gotlieb, 1955). Только при реактивации штамма Mel, инактивированного ультрафиолетом, инфекционным штаммом WSN было выявлено существование рекомбинантов М+, хотя нейровирулентность некоторых рекомбинантов была нестабильной и менялась от пассажа к пассажу (Gotlieb, Hirst, 1956). Однако некоторые штаммы потомственного вируса Mel-типа, ненейровирулентные при прямом интраце-ребральном введении мышам, являлись, как было показано, потенциально или стенотипически нейровирулентными, поскольку их скрещивание с W~ — иенейровирулентным реком-бинантом — приводило к образованию несомненно нейротроп-ного WSN. Этот феномен аналогичен перераспределению вирулентности, наблюдавшемуся в 'исследованиях Burnet и соавт. (раздел IA, 1д). Вирулентность рекомбинантов М+ изменялась от полного отсутствия до почти эквивалентной штамму WSN, причем доминировали невирулентные формы. В фенотипичеоки невирулентном рекомбинанте М+ ген нейро-вирулеятности, по-видимому, имел препятствие для своего проявления при комбинировании с серотипом Mel. Только при его рекомбинации с серотипом WS вирулентность восстанавливалась до уровня последнего.

в) Роль гетерозигот в рекомбинации. В ряде опытов смесь вирусов Mel (М~) и WSN (W+), -каждый при высокой концентрации, инокулировали в аллантоисную полость целых куриных эмбрионов или оплодотворенных яиц (Hirst, Gotlieb, 1955). Клоны выделяли при предельном инфекционном разведении (разведение, при котором 25% эмбрионов или меньше оказываются зараженными) из смешанных урожаев вируса без использования антисыворотки в целях селекции. Из 220 выделенных клонов при дальнейших пассажах 85 давали урожай только М-типа, а 58 — только W-типа. Оставшиеся 77 клонов давали начало обоим типам (М и W) при следующей генерации. Эти клоны были, следовательно, серо-типическими гетерозиготами или, более точно, диплоидами,

ибо так называемые гетерозиготы часто являются гетерозиготными по нескольким факторам. Потомство W-типа, полученное из таких гетерозигот, содержало поразительно высокую долю ненейровирулентного WSN [(W~) рекомбинанта относительно серотипа и нейровирулентности], а именно 41 клон из 77. В противоположность этому только 2 из 58 гомозиготных клонов W-типа были W~. Hirst и Gotlieb (1955) предположили, что гетерозиготы являются предварительной стадией, приводящей к образованию рекомбинантов. Так как гетерозиготы тоже были фенотилически смешанными, т. е. подверженными двойной нейтрализации, использование антисыворотки для целей селекции определенного типа потомства сильно снижало шансы обнаружить рекомбинанты. В данных исследованиях этих авторов доля гетерозигот обычно была очень высока (в описанных выше опытах — 77/220, или 35%). С другой стороны, Lind и Burnet (1975a) обнаружили гетерозиготы в меньшей пропорции: три серотипические гетерозиготы в 24 клонах, выделенных при скрещивании штаммов NWSE и Mel. Более того, они выявили высокую долю рекомбинантов и не считали, что гетерозиготы играют сколько-нибудь значительную роль в их производстве. Почему возникло такое расхождение в результатах, полученных двумя группами авторов, объяснить нельзя. Существование гетерозигот само по себе сомнительно, особенно в свете недавних полученных данных об универсальном феномене существования агрегатов вирусных частиц '(Hirst, 1973). Представляется, что роль гетерозигот или агрегатов в формировании рекомбинантов остается пока невыясненной.

В течение первого периода исследований отсутствие точных методов подсчета инфекционного вируса и надежных способов получения чистых клонов являлось главным препятствием на пути к прогрессу. Инфекционность приходилось измерять путем титрования в аллантоисной полости куриных эмбрионов, а единственным практическим способом .получения чистых клонов было использование повторяющихся пассажей при предельных инфицирующих разведениях опять-таки в аллантоисной полости. Любые сколько-нибудь значительные опыты требовали огромного количества эмбрионов. Burnet сам описал эту ситуацию. После 10-летнего изучения рекомбинации вирусов гриппа и многих попыток свести эти явления в удовлетворительную модель (некоторые из этих попыток были опубликованы) автор был вынужден отступить на почти нигилистические позиции. Во всех количественных экспериментах непостоянство результатов таково, что для данных по обнаружению, например, линейной последовательности генетических детерминант определенных свойств были бы необходимы столь обширные опыты, которые превышают возможности любой лаборатории, интересующейся подобной

проблемой. Возможно, сейчас есть смысл всем группам, интересующимся генетикой вируса гриппа, прекратить публикацию статей на эту тему. Нет сомнения во всех получаемых фактах, но отсутствует теоретическая основа, в рамках которой они могут быть представлены (Burnet, 1960).

Однако, несмотря на ограничения, замечательно то, что эти ранние работы оказали существенное влияние на дальнейшие исследования. Почти все основные концепции, все еще распространенные сейчас,—фенотипическое смешение, гетерозигозис, сцепленные группы, высокая частота рекомбинации, генетическая компетентность инактивироваиного вируса — были сформулированы уже в тот период.

Б. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ГЕНЕТИКЕ ВО ВТОРОМ ПЕРИОДЕ

Второй период начался работой, проведенной Simpson и Hirst (1971), которые впервые применили метод бляшек в исследованиях генетики вируса гриппа. Несмотря на плодотворное использование ими культур клеток и метода бляшек и последующие технические усовершенствования, прогресс в этой области ограничивался разборчивостью большинства штаммов вируса гриппа по отношению к культурам клеток в отличие от других вирусов, которые легче могут быть адап- ri тированы к культурам клеток. Эта проблема, беспокоящая нас и сегодня, является причиной пристрастия исследователей в работах по генетике к вирусам WSN, NWS и к вирусу чумы птиц (ВЧП), которые хорошо образуют бляшки во многих системах культур клеток. Поскольку изыскания этого периода являются по существу исследованиями нынешнего дя-я и едва ли нуждаются в детальном описании и переосмыслива-нли, основные достижения будут суммированы лишь в весьма сжатом виде.

Simpson и Hirst (1961) использовали штамм WSN как донор бляшкообразующих свойств для других штаммов вируса гриппа типа А, не образующих бляшек совсем или образующих их плохо с очень низкой эффективностью на клетках куриного эмбриона. WSN давал урожай с высоким титром и образовывал большие и четкие бляшки с эффективностью, почти равной эффективности заражения эмбрионов в аллан-тоисную полость. Смешанная инфекция клеток куриного эмбриона вирусом WSN, инактивированным ультрафиолетовым облучением, и штаммами инфекционными, но не образующими бляшек или образующими их плохо, приводит к появлению бляшек в количествах, значительно превосходящих те, которые обусловлены остаточной инфекционностыо WSN. Большинство бляшек, полученных вследствие кросс-реактивации, по своим размерам и морфологии заметно отличались от бляшек, образуемых вирусом WSN. Штаммы вирусов, выделенные из таких бляшек, обычно обладали свойствами, унаследованными от реактивированных, не образующих бляшек, родительских штаммов. Кросс-реактивация оказалась очень эффективным способом получения рекомбинантов и таким путем были получены бляшкообразующие рекомби-нанты многих серотипов: WS, Mel, PR8, FM-1, S-1, Япония 305 и грипп свиней.

В 1962 г. Hirst выдвинул гипотезу, которая должна была послужить основным толчком к дальнейшим исследованиям вируса гриппа. Эта гипотеза состоит по существу из двух отдельных, хотя и взаимосвязанных, постулатов. Во-первых, автор предположил, что количество РНК, содержащейся в геноме вируса гриппа, меняется от частицы к частице. Этот вывод был сделан на основании физической и морфологической 'Гетерогенности, наблюдаемой у вирусных частиц в стандартных препаратах, несовершенства способа созревания вирусов и частого появления гетерозигот. За исключением неполного вируса (феномен фон-Магнуса), обоснованность этого предположения сегодня еще далеко не доказана, что будет обсуждаться в разделе VA, 3. Во-вторых, РНК вируса гриппа существует в виде еубгеномных фрагментов, способных, возможно, полуавтономно реплицироваться и случайно перераспределяться в процессе сборки вирионов. Исходя из размеров РНК вируса гриппа и основываясь на опыте, приобретенном при работе с ДНК-содержащими бактериофагами и полиовирусом, нельзя было ожидать частоты рекомбинации большей, чем 1%, если она имеет тот же механизм. Наблюдаемый значительно более высокий уровень рекомбинаций мог быть объяснен только генетическими воздействиями, происходящими по какому-то необычному механизму. Прототип этой гипотезы можно обнаружить уже в работах 1952 г., в которых предполагались группы сцепления (см. раздел IA, 1'в), а подобный механизм рекомбинации менее точно был определен в работе Burnet (1956). Но разграничения между разными 'Субгеномными фрагментами и множеством копий с одного и того же фрагмента в то время проведено не было. В этой гипотезе определенно был провозглашен лишь экстраординарный механизм генетических взаимодействий. Спустя 4 года гипотеза «дробного генома» была частично подтверждена открытием небольших и гетерогенных фрагментов РНК, экстрагируемых из вируса гриппа (Davis, Barry, 1966), а также множеством биофизических и химических данных, приводящих к такому же заключению (Shatkin, 1971; Young, Content, 1971; Lewandowski et al., 1971; Bishop et al., 1971; Skehel, 1971; Horst et al., 1972; Bromley, Barry,1973).

Tumova и Pereira (1965) использовали метод Simpson и Hirst (1961), но они выбрали вирус чумы птиц (FPV) как

бляшкообразующий вирус, который должен быть реактивирован, и вирус А2 — как реактивант. Все более чем 50 клонов, полученных из реактивированных бляшек, содержали НА FPV. Однако тест на 'Штаммоепецифическую фиксацию комплемента примерно в половине ракомбинантов выявил в дополнение ж FPV-антигену и А2-антиген. Позже А2-антиген, содержащийся в одном из таких антигенных гибридов FPV-A2 (R4), был идентифицирован как NA вируса А2 (Eas-terday et al., 1969).

Одновременно и независимо проведенные эксперименты Kilbourne и соавт. (Kilbourne, Schulman, 1965; Jahiel, Kilbour-ne, 1966; Kilbourne et al., 1967) с рекомбинантами вирусов NSW (H0N1) и RI/5+ (H2N2) убедительно показали с помощью ряда серологических методов легкость получения «антигенных гибридов». Успеху этих экспериментов способствовало применение новой бляшкообразующей системы для вируса гриппа — анеуплоидных клеток человека, клон 1-5С-4 (Sugiura, Kilbourne, 1965). Поскольку м'ногие штаммы, включая NWS, образуют бляшки на этой линии клеток, можно было подсчитать все типы потомственного вируса, образующегося при смешанной инфекции, что позволяло определить частоту рекомбинации. При использовании двухфакторного скрещивания, включающего вид оеротила и тип бляшек, было показано, что частота рекомбинации достигает 34% после одноциклового роста штаммов NW.S и 'САМ, что подтверждало данные, полученные ранее Burnet и Lind (1952) (см. раздел IA, 1г) i(Sugiura, Kilbourne, 1966).

В этой системе с помощью феномена уменьшения размера бляшек было выявлено существование двух видов антигенов на поверхности вируса (Kilbourne, Schulman, 1965; Jahiel, Kilbourne, 1966); это было сделано при изучении свойств вируса Х7 — антигенного гибрида, полученного путем скрещивания вирусов NWS и A2/RI/5+/57. Антисыворотка к NWS или к RI/5, включенная в агаровое покрытие, оказывала существенно разное влияние на образование бляшек вирусом Х7 на клетках клона 1-5С-4. В то время как анти-NWS-cbiBO-ротка либо полностью предотвращала появление бляшек, либо уменьшала как количество, так и размер бляшек, выявляющихся при конечных разбавлениях (ингабирование бляшек), анти-Ш/б-сыворотка заметно уменьшала лишь размер бляшек, не влияя на их число, в широком диапазоне концентраций сыворотки ' (уменьшение размера бляшек). Анти-Ш/5-сыворотка практически не влияла на Х7 в реакции нейтрализации перед инокуляцией и не подавляла гемагглютинации вируса Х7. AHTH-NWS-сыворотка, с другой стороны, нейтрализовала инфекционность и подавляла гемагглютинацию. Вирус Х7, помимо НА*, полученного несомненно, от NWS, содержал 'антигенную детерминанту,

полученную от вируса А2. Ранее было показано, что иммунизация мышей вирусом Х7, известным тогда как вирус X (Kilbourne, Schulman, 1965), обеспечивает защиту против введения любого из родительских вирусов. То, что А2-антиген в действительности являлся NA*, было доказано Laver и Kilbourne (1966) путем злектрофоретического анализа вирусных структурных белков.

После Х7 Kilbourne (1968) аналогичным образом получил несколько рекомбинантов, содержащих НА* вируса гриппа свиней и NA* вирусов гриппа человека. Эти результаты вместе с отмеченными выше данными Tumova и Pereira (1965) привели к заключению, что способность к рекомбинации универсальна для всех вирусов гриппа А независимо от видов хозяина, из которых они были выделены.

■Выявление NA* как компонента, антигенно отличного от НА*, и существование рекомбинации по этим двум компонентам является, вероятно, основным вкладом генетических экспериментов в выяснение структуры 'вириона, но в сочетании с обнаружением генетической совместимости между вирусами человека и животных, также я в понимание экологических свойств вируса гриппа (см. гл. 9 и 16).

В течение (многих лет почти все исследования по генетике проводились с использованием природных штаммов вирусов, отличающихся по ряду 'биологических свойств. Обусловлено ли выявляемое отличие одним геном или оно полигенно по своей природе, —было неизвестно. Более того, хотя для вируса гриппа пригодно, по-видимому, множество маркеров, большинство из них служило, вероятно, проявлением действия лишь нескольких генов, в частности тех, которые имеют отношение к белкам поверхности вириона. Изменения в белках, находящихся внутри оболочки, не могли быть распознаны. Fenner и Sambrook (1964) указали на недостатки такого подхода и подчеркнули важность применения условно-летальных мутантов, которые -были успешно использованы в генетике бактериофагов. Это — мутанты, которые не дают инфекционного потомства при определенных, легковоспроизводи-мых условиях, но которые реплицируются нормально или почти нормально при других условиях. Теоретически можно было бы получить мутанты, лишь на один шаг отстоящие от родительского штамма или дикого типа вируса. Из-за отсутствия в клетках животных супрессорчувствительных механизмов (Fenner, 1970) большинство условно-летальных мутантов из вирусов животных являются темлературочувствитедь-ными.

Первое выделение температурочувствительных условно-летальных (ts) мутантов было описано Simpson и Hirst (1968).' Между определенными парами этих мутантов наблюдались как рекомбинация, так и комплементация, и они были

раз-биты «а пять жомллементационных групп. Эта была другая поворотная точка в исследованиях генетики вируса гриппа. С тех лор различные группы исследователей выделили многие ts-мутанты, но они будут описаны далее.