- •I. Введение. Грипп — заболевание с неизменяющейся симптоматикой, вызываемое изменяющимся вирусом
- •II. Таксономия вирусов гриппа
- •IV. Структурное и функциональное родство вирусов гриппа с другими рнк-содержащими вирусами
- •V. Антигенная изменчивость вируса гриппа и ее отличие от антигенной изменчивости других инфекционных агентов
- •VI. Нерешенные вопросы
- •Структура вируса гриппа
- •I. Введение
- •1. Число и функции полипептидов
- •4. Нейраминидаза
- •5.Белок нуклеокапсида
- •7. Количество полипептидов в вирионе
- •8. Вирусы гриппа в и с
- •1. Гемагглютинин
- •2. Нейраминидаза
- •IV. Сборка вирионов
- •V. Заключение. Модель вириона гриппа
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин
- •II. Реакция гемагглютинации
- •1. Количественное определение гемагглютинации
- •2. Гемадсорбция
- •3. Ингибирование гемагглютинации
- •III. Структура гемагглютинина
- •1. Химический состав изолированных гликопептидов
- •2. Антигенные свойства гликопептида hAt
- •4. Структура субъединицы на
- •5. Антигенная гомогенность субъединиц на
- •1. Моновалентный гемагглютинин
- •2. Агрегация и диссоциация моновалентного гемагглютинина
- •IV. Функции гемагглютинина
- •V. Заключение
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Нейраминидаза
- •II. Специфичность нейраминидазы
- •III. Субстраты для нейраминидазы
- •IV. Химические свойства нейраминидазы
- •V. Содержание нейраминидазы в оболочке вируса
- •1. Использование протеолитических ферментов
- •2. Использование детергентов
- •VI. Свойства изолированной нейраминидазы а. Состав аминокислот
- •VII. Структура нейраминидазы
- •VIII. Антигенные свойства нейраминидазы
- •IX. Лектины и нейраминидазы
- •X. Ингибиторы активности нейраминидазы
- •XI. Роль нейраминидазы
- •Биологически активные белки вируса гриппа. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа
- •I. Введение
- •II. Активность рнк-полимеразы в инфицированных клетках
- •IV. Заключение
- •Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
- •I. Введение
- •II. Методы
- •1. Экстракция рнк из вирионов
- •1. Анализ экстрагированной рнк с помощью градиентного центрифугирования
- •2. Анализ экстрагированной рнк с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (паагэ)
- •IV. Комплекс рнк с белком (рнп) а. Физические и химические свойства
- •2, Созревание и упаковка рнк в вирионы
- •1. Внутриклеточная локализация вкРнк
- •2. Кинетика синтеза вкРнк
- •3. Физические свойства информационной рнк (мРнк)
- •VI. Действие ингибиторов на синтез рнк
- •VII. Заключение
- •Генетика вируса гриппа
- •I. Введение. Исторический обзор
- •1. Исследования по генетике, проведенные Burnet и сотрудниками
- •2. Исследования по генетике, проведенные Hirst и Gotlieb
- •II. Геном вируса гриппа
- •III. Мутации, изменчивость, адаптация
- •1. Модификация вирусных гликопротеидов
- •2. Модификация вирусной оболочки
- •3„ Модификации с помощью протеолитических ферментов
- •1964) Или к гуанидвнгидрохлориду (David-West, 1973) явля
- •2. Фенотипы, относящиеся к нейраминидазе
- •3. Морфология вириона
- •1. Чувствительность к клетке-хозяину
- •2. Патогенность
- •3. Механизм рекомбинации
- •10% От выхода вируса при разрешающей температуре. Шля1
- •V!. Фенотипическое смешение и гетерозигозис
- •VII. Изучение функции генов с помощью ts-мутантов
- •VIII. Заключение
- •Репликация вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Адсорбция, проникновение, «раздевание» вируса
- •III. Транскрипция а. Последовательность синтеза рнк
- •2. Циклогексимид
- •3. Глюкозамин
- •IV. Синтез вирусных белков
- •2. Белок нуклеокапсида
- •3. Неструктурные белки
- •4. Мембранный м-белок
- •5. Гемагглютинин
- •VI. Синтез липидов
- •VII. Сборка (см. Также гл. 2)
- •IX. Неправильные формы размножения
- •Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинического материала
- •I. Введение
- •II. Культивирование вирусов в лабораторных условиях
- •1. Продуктивная инфекция
- •2. Абортивная инфекция
- •3. Персистентная инфекция
- •4. Параметры инфекции
- •IV. Выделение вируса
- •Антигенная изменчивость вируса гриппа
- •I. Введение
- •II. Грипп в историческом аспекте (см. Также гл. 15)
- •III. Свойства генома вируса гриппа
- •IV. Субъединицы гемагглютинина
- •V. Механизм антигенного дрейфа
- •1955, 1956; Magill, 1955; Hamre et al., 1958). Эпидемиологиче
- •1956, 1957; Takatsy, Furesz, 1957), антигены постепенно за
- •VI. Механизм антигенных сдвигов (значительных антигенных изменении)
- •VII. Дополнительные доказательства,
- •2. Естественная передача вируса и селекция
- •3. Селекция и передача «нового» вируса гриппа в системе in vivo
- •1. Антигенные соотношения между вирусами гриппа человека, низших млекопитающих и птиц
- •2. Круг хозяев
- •Иммунология гриппа
- •I. Введение
- •II. Проявления иммунитета
- •1. Устойчивость к инфекции
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •2. Изменение заболевания
- •3. Передача вируса
- •4. Механизм действия антител к na
- •V. Влияние антигенного дрейфа на иммунитет
- •VII. «первородный антигенный грех»
- •VIII. Клеточный иммунитет и грипп
- •IX. Заключение
- •Грипп у человека
- •2. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа а
- •3. Инфекция, вызываемая вирусом гриппа в
- •7. Изменения бактериальной флоры
- •8. Функция легких при неосложненном гриппе
- •9. Выделение больными вируса в окружающую среду
- •10. Интерферон
- •11. Продукция антител
- •1. Пневмония
- •2. Острые заболевания нижних дыхательных путей у детей
- •3. Обострение хронического бронхита
- •III. Экспериментальная гриппозная инфекция у человека
- •3. Продукция интерферона при заболевании
- •IV. Выводы и заключение
1. Использование протеолитических ферментов
Протеолитические ферменты различной специфичности или смесь протеолитических ферментов (таких, как пролаза) могут использоваться для солюбилизации NA* в активной форме. Это свидетельствует, во-первых, что активный центр NA* в высокой степени устойчив к протеолизу и, во-вторых, что отрыв гидрофобного «хвоста» может быть осуществлен практически любым протеолитвческим ферментом. Для отщепления необходимо наличие нескольких ключевых аминокислот; произойдет ли гидролиз в том или другом месте — не имеет большого значения. Протеолитические ферменты обычно попользуются в высоких концентрациях (1—2 мг/мл и выше), которые сравнимы с .концентрацией вирусных (белков при малом времени инкубации. Поскольку NA* вируса находится в «нативном» состоянии, она, по-видимому, более устойчива к протеолизу, чем после денатурации фермента. Углеводные остатки NA* могут играть роль «защитников» фермента от атаки протеолитичеокими ферментами, а также «направлять» протеолитические ферменты к специфическим областям, в которых должен произойти разрыв цепи. Что касается ферментов, используемых для солюбилпзации NA*, то следует отметить, что трипсин, обладая наивысшей из всех
известных эндопептидаз степенью специфичности места разрыва, расщепляет |бело,к в области карбоксильного конца остатков лизина и аргинина (Walsh, 1970). Химотрипсин расщепляет белок преимущественно по ароматическим аминокислотам полипептидной цепи (Wilcox, 1970). Пептидаза На-гарсе (или субтилизин BPN') является сериновой протеазой, расщепляющей большое число пептидных и эфирных связей (Ottesen, Svendsen, 1970). Проназа представляет собой смесь нескольких протеолитических ферментов, включая эндопеп-тидазу и экзопептидазу, .продуцируемые штаммом Streptomy-ces griseus K-l (Narahachi, 1970).
2. Использование детергентов
Детергенты, используемые для изоляции вирусных <NA:1\ можно разбить на две основные группы: ионные (преимущественно анионные) и неионные детергенты. К числу основных детергентов первой группы, используемых для солюбилизации NA* с сохранением ее ферментативной активности, следует отнести додецилсульфат натрия (SDS) и дезоксихолат натрия. Оба вещества относятся к числу сильных детергентов анионного типа. NA* штаммов A0(Nl) чувствительна к SDS (Gregoriades, 1972; Laver, Baker, 1972) и инактивирует-ся в присутствии этого детергента, в то время как NA* штаммов А2 (N2) может быть изолирована с помощью SDS-co-любилизации. Отношение 2:1 по массе белка к детергенту является оптимальным для изоляции NA* типа ;N2 с сохранением ее активности (Laver, 1963; Rott et al.. 1970). Использованные ранее неионные детергенты относились к серии твинов: твин-20 или твин-80, часто в смеси с эфиром. Позднее использовали детергент NP40 (Gregoriades, 1972) и тритон Х100 (Bucher, 1973, 1975). Неионные детергенты обычно обладают более низкой инактивирующей способностью, чем ионные. Как и в случае протеолитических ферментов, тип детергента не оказывает существенного влияния на свойства выделяемого фермента в случае, если не происходит его инактивации.
Успешное выделение NA* в активном состоянии с помощью электрофореза в целлюлозоацетатных пластинах (Laver, 1963, 1964) в присутствии SDS зависит от того, имеем ли мы дело с SDS-чувствительным НА* и SDS-нечувствительной NA*, После разрушения вирусных частиц с помощью SDS NA*, мигрирующая под действием эндооомотического потока, движется к катоду и отделяется от НА*. Для штаммов типа А2 НА* и NA* мигрируют совместно (к катоду), и для выделения NA* требуется провести генетическую рекомбинацию с более ранними вариантами вируса гриппа для того, чтобы получить НА*, инактивируемый в присутствии SDS (мигрирующий к аноду). NA штамма NWS (N1) денатурирует в присутствии SDS.
Б. ОЧИСТКА НЕЙРЛМИНИДАЗЫ
Вслед за солюбилизацией NA* из препаратов очищенного вируса ее можно выделить с использованием комбинации се-диментационных, хроматографических и (или) электрофоре-тических методов. Поскольку активный фермент имеет константу седиментации 8—10S, а другие вирусные компоненты могут иметь более низкие или 'более 'высокие скорости седиментации, обычно первым этапом очистки является ультрацентрифугирование, выполняемое чаще с использованием градиента либо сахарозы, либо глютамата натрия. Последний метод удобен тем, что при его использовании можно прямо измерить активность NA* с помощью тиобарбитуровой кислоты без нежелательного влияния сахарозы (Biddle, 1968). С помощью относительно низкоскоростного центрифугирования обычно отделяют NA* от вирусных частиц, а при втором центрифугировании с более высокой скоростью или с более крутым сахарозным градиентом отделяют медленно седимен-тирующие вирусные белки от NA*, которая седиментирует с большей скоростью.
Последующие этапы очистки обычно включают хромато-графические методы разделения макромолекул либо по размерам, 1как в случае гель-фильтрации с использованием се-фадекса G-200 или биогеля Bio-Red A5 (Kendal et al., 1968; Bucher, Kilbourne, 1972), либо методы разделения с использованием ионообменных смол, таких, как DEAE-целлюлоза, на которой NA* типа iNl довольно эффективно адсорбируется при нейтральных значениях рН (Gregoriades, 1972). Laver (1963, 1964) использовал метод электрофореза на целлюло-зоацетатных пластинах в присутствии SDS. В связи с тем что метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS позволяет проводить разделение 'макромолекул по размерам (Weber, Osborne, 1969), этот вид электрофореза был использован для выделения NA* вируса гриппа (Bucher, Kilbourne, 1972). Для изоляции из смеси белков солюбили-зированной с помощью детергентов NA* использовали и метод электрофокусировки (Gregoriades, 1972). Очистить NA* благодаря ее ферментативной активности можно методом афинной хроматографии при использовании колонки с низкомолекулярным ингибитором нейраминидазной активности — N-p-аминофенилоксамовой кислотой (Cuatrecasas, II-liano, 1971; Bucher, 1973, 1975). Если учесть, что NA* вируса гриппа представляет собой гликопротеид, ее можно выделить, используя афинную хроматографию с использованием лекти-нов (Hayman et al., 1973).
В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ
После изоляции NA* из вирионов можно использовать несколько ^ критериев ее чистоты. Один из них — увеличение удельной активности в стандартных условиях. Если принять, что NA* составляет 7% всех белков вириона, то максимальное увеличение удельной активности препарата может составлять 14—15 раз. Однако этот критерий очень трудно использовать на практике, поскольку, с одной стороны, имеет место увеличение активности . NA* при выходе ее из вириона, а с другой — на ее активность одновременно влияет большое число денатурирующих факторов в зависимости от условий солюбилизации и типа используемого штамма вируса. В связи с этим очень трудно судить о степени очистки NA*, основываясь на ее удельной активности.
В качестве критерия чистоты препарата NA* использовали отсутствие адсорбции его на эритроцитах, однако, несмотря на наличие этого свойства, препарат все же может сохранять способность к индукции антител к НА* (Wilson, Rafelson, 1963; Drzeniek, Rott, 1963). Таким образам, дополнительным критерием степени чистоты выделенной NA* может быть то, что при ее использовании в качестве иммуногена не продуцируются антитела к другим компонентам вириона.
Поскольку в настоящее время: хорошо известно положение полосы NA* при электрофорезе в полиакриламидном геле, одним из критериев ее чистоты может быть присутствие одной полосы высойомолекулярногб гликопротеида при проведении электрофореза в невосстанавливающих условиях. После восстановлений эта полоса должна превратиться, в одну или две полосы, положение которых соответствует относительной молекулярной массе приблизительно 60 000 при полном отсутствии других полос. В этом случае на полиакрил-амидный гель следует нанести 5—10 мкг белка