V. Содержание нейраминидазы в оболочке вируса

Как было определено, для таких штаммов вируса гриппа, как А0/Ве1/42, который содержит нейраминидазу типа N1 (Skehel, Schild, 1971), как рекомбинант Х7, в состав которого входит нейраминидаза типа N2 (Laver, Kilbourne, 1966) и вируса гриппа В, штамм B/Lee (Laver, 1963), содержание нейраминидазы составляет около 7% от суммарного содержания белков в вирионе. Несмотря на совпадение величин, полученных в этих работах, было обнаружено, что количество нейраминидазы, включающейся в вирусную частицу, может быть недостаточным и зависит от типа клеток, на которых выращивают вирус, и от штамма вируса. Laver (1963) обнаружил, что количество NA* зависит от типа клеток-хозяев и составляет 6% от общего вирусного белка при выращивании вируса in ovo и 14%, если вирус выращивается на клетках почки теленка. Laver и Kilbourne (1966) обнаружили, что в рекомбннантном штамме X7(F1) (H0N2) содержится в 2 раза больше «ейраминидазы, чем в штамме X7(H0N2) при выращивании вирусов in ovo. Palese и Schulman (1974) обнаружили десятикратное различие в содержании нейраминидазы в двух антигенно идентичных лабораторных рекомби-нантах вируса гриппа (H0N2), выращенных in ovo. Mow-showitz и Kilbourne (1975) наблюдали подобные различия в нейраминидазной активности изолированных вирусов двух

штаммов Aichi (H3N2) дикого типа. Используя метод подсчета частиц, Seto (1964) обнаружил, что неполный вирус штаммов PR8 (H0N1) и Япония/305 (H2N2) обладает нейр-аминидазной активностью, в 2—4 раза меньшей, чем стандартный вирус.

Если считать, что содержание NA* составляет 7% суммарного (белка вириона (а белок составляет 70% массы всей вирусной частицы) (Frommhagen et al., 1959), и принять за массу одной вирусной частицы величины W = 4-10~16 (Reimer et al., 1966), то число молекул NA* на один вирион можно определить из следующего уравнения (Skehel, Schild, 1971). Предполагается, что NA* представляет собой тетрамер с относительной молекулярной массой 24 000 (Wrigley et al., 1973), а N — число Авогадро:

^%NA = 49 молекул NA па вирион

Kendal и соавт. (1968) определили абсолютное содержание белка на один вирион, равное 4-Ю-16 г, и, основываясь на содержании NA* в 10% от суммарного белка вириона и на ее молекулярной массе в 220 000, рассчитали, что в вирионе гриппа штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) содержится 100 молекул NA* на одну вирусную частицу. Поскольку, согласно расчетам Tiffany и Blough (1970), на поверхности вирусной частицы содержится 550—600 «шипов», можно считать, что 50—100 из них представляют собой NA*, а остальные 500—'НА*.

А. СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ

Для изучения свойств NA* (как ферментативных, так и антигенных) удобно иметь 'фермент, отделенный от других компонентов вирусной оболочки. Поскольку NA* локализована в вирусной оболочке, именно это предопределяет способы ее солюбилизации и отделение от вириона и других вирусных компонентов. Методы солюбилизации NA* можно разделить на две группы: а) солюбилизация с помощью протеолитиче-еких ферментов и б) солюбилизация с помощью поверхностно-активных веществ. Особенности выделения NA* с помощью обоих методов приведены в табл. 13.

Солюбилизация .NA*, по-видимому, не меняет ее ферментативных свойств. Активная в биологическом и антигенном отношении NA* была выделена протеолизом или с помощью поверхностно-активных веществ ионной и неионной природы (Drzeniek et al., 1966). После выделения NA* имела ту же, что и до выделения, величину Км, оптимум рН и Са2+-зави-симость (Drzeniek et al,, 1966). Выделенную из вириона после обработки детергентами или протеолитическими ферментами iNA* нейтрализовали антисывороткой в той же степени, что и NA* интактного вириона (Ea'sterday et al., 1969). Одна-

ко Webster и Laver (1967) обнаружили, что выделенная с помощью детергента -NA* типа N2 обладает «дефицитом» анти-генности по сравнению с антигенностью NA* того же типа in situ.

Было показано, что iNA* вируса гриппа штамма B/Lee является наиболее стабильной и может -быть выделена практически с 100% выходом после обработки вирионов SDS или трипсином (Laver, 1963). NA* вируса B/Lee, кроме того, нечувствительна к дезоксихолату натрия (Laver, 1963). Что .касается вируса гриппа типа А, то наиболее просто с помощью обработки SDS или протеолитическими ферментами выделяется -NA* из штаммов А2 (N2). Эта NA*, кроме того, относительно температурно-етабильна. Использование нейтральных детергентов позволило выделить NA* типа N2 (Webster, Darlington, 1969), а также iNA* типа N1, выделение которой в чистом виде особенно трудно (Gregoriades, 1972). Hoyle и Almeyda (1971) показали, что NA*, выделенная из штаммов вируса гриппа типа А2 (N2) и B/Lee, почти полностью устойчива к действию проназы и трипсина; NA*, выделенная из штаммов PR8 (N1) и свиного (N1), лишь отчасти устойчива, a NA* вируса гриппа типа А1 (N1) и штамма A/DSP (<N1) крайне чувствительна к проназе и трипсину. NA* вируса гриппа типов АО и А1, (Которые также чувствительны к действию протеолитических ферментов, разрушается под действием SDS и мочевины (Hoyle, Almeyda, 1971).

Для солюбилизации NA* такие методы, как разрушение ультразвуком, эфиром или денатурирующими агентами (мочевина или гуанидингидрохлорид), применимы в малой степени, вероятно, в связи ,с высокими агрегационными свойствами этого фермента. Разрушение вирионов с помощью эфира, по-видимому, высвобождает НА* и NA* в виде сополимер-ного агрегата (Hoyle, 1952; Davenport et al., 1960; Schafer). Этот вид разрушения вирусных частиц в основном использовали до того, как Laver изолировал NA* (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Paucker et al., 1959; Hoyle et al., 1961).

Предпочтительным является такой ,вид изоляции NA*, который не требует разрушения ковалентных связей. Использование детергентов для солюбилизации iNA* позволяет выделить и другие вирусные белки, которые в химическом отношении не отличаются от соответствующих вирусных компонентов, хотя и могут терять свою биологическую активность (Bucher, 1975). По-видимому, при протеолитической солюбилизации NA* теряет некоторую часть своей молекулы, необходимую для удержания фермента на вирусной оболочке и не участвующую в ферментативном акте. Lazdins и соавт. (1972) показали, что в отличие от изоляции NA* с помощью детергента (SDS) или лротеолитичеоком (трипсин) выделении из штамма B/Lee каждая субъединица фермента теряет

отрезок -молекулы в 7000; по данным Wrigley и соавт. (1973), при тех же условиях каждая субъединица NA* B/Lee теряет участок в 12 000.

Основное различие, наблюдаемое при лротеолитическом и детергентном выделении NA*, состоит в том, что при солюби-лизации с помощью протеолитичеоких ферментов она теряет способность к агрегации. При (протеолитичеоком выделении имеет место «действительная» солюбилизация, в то время как iNA*, полученная с помощью детергентов, агрегирует при удалении солюбилизирующего агента (Lazdins et al., 1972). Каждый этап очистки NA* после ее солюбилизацин с помощью детергента должен выполняться в его присутствии для того, чтобы, во-первых, иметь дело с ферментом в диссоциированном состоянии, а Ео-вторых, для предотвращения потери его активности. Laver и Valentine (1969), а также Rott и соавт. (1970) показали наличие агрегатов в препаратах iNA* типа N2 при удалении детергента. По данным Grego-riades (1972), при удалении детергента NA* штамма WSiN (N1) агрегирует и теряет свою активность. Webster (1970b) обнаружил высокую агрегационную способность для NA*, выделенной из вирионов с помощью детергента, даже в присутствии 6 М гуанидингидрохлорида в условиях восстановления.