1. Экстракция рнк из вирионов

Вирус, очищенный по описанной методике и осажденный для удаления сахарозы, переводят в малый объем буфера STE (обычно 0,2—0,4 мл). После полного ресуспендирования осадка добавляют 1—2 мл буфера SLA (0,5% SDS, 0,14 М LiCl в 0,01 М ацетатного буфера, рН 4,9) и равный объем смеси свежеперегнанного водонасыщенного фенола с хлороформом (1 : 1). Смесь взбалтывают 'вручную в течение 4 мин, фазы разделяют центрифугированием на низкой скорости и верхний водный слой осторожно отсасывают без нарушения целостности интерфазы. После добавления двойного объема 95% этанола РНК выпадает в осадок в течение ночи яри температуре —20°С, осадок отделяют центрифугированием, растворяют в подходящем буфере и вторично осаждают спиртом. Если предполагается проводить анализ РНК с помощью

ПААГЭ, крайне важно, чтобы РНК после первого осаждения спиртом растворялась в электрофорез-ном буфере (5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, 0,05% SDS, 5 мМ трис-HCl, рН 7,4). Если концентрация NaCl хотя бы немного превысит величину 10 мМ, это приведет к тому, что большое количество РНК останется в верхней части геля, а электрофореграмма 'будет низкого качества.

Из клетки могут .быть экстрагированы три типа вирусспе-цифичеоких РНК: 1) вирлонная РНК (вРНК); 2) РНК, комплементарная к вирионной (вкРНК); 3) двунитчатая РНК (днРНК). Относительно чистую вРНК удается изолировать из нукленново-белкового комплекса — рибонуклеопротеида (РНП). Метод выделения будет описан в разделе VA, 1 этой главы). Выделение вкРНК обычно происходит при выделении РНК из препарата полисом, поскольку основная часть, если

не вся вирусная информация (мессенжер) РНК (мРНК), представляет собой вкРНК (раздел VB,1).

В нескольких работах 'была описана изоляция из инфицированных клеток вирусопецифической днРНК (Pons, 1976b;. Pons, Hirst, 1968b). Метод изоляции включает обработку инфицированных клеток смесью фенола с SDS с последующей хроматографией изолированной РНК на колонках с целлюлозой CFll (Franklin, 1966) и выделением продукта, на 90% состоящего из молекул, устойчивых ,к обработке РНК-азой. РНК, изолированные этими -методами, при изучении их с помощью ПААГЭ, давали шесть хорошо разрешенных фрагментов вирусспецифичехжой РНК (26). Денатурация днРНК с помощью диметилсульфоксида приводила «к возникновению однонитчатых РНК (онРНК) с электрофоретической подвижностью, эквивалентной таковой фрагментов вРНК (Pons, Horst, 1968b).

В. АНАЛИЗ ЭКСТРАГИРОВАННОЙ РНК

В настоящее время имеется много методов изоляции вирусной РНК из инфицированных клеток и вирионов. Выбор того или иного метода диктуется в большой степени методикой анализа продукта и тем, жак этот продукт будет использоваться. Это означает, что если необходимо изучить 'биологическую активность экстрагированной РНК, то в процессе выделения желательно присутствие малых количеств Mg2+. Однако наличие в системе Mg2+ приводит к агрегации РНК вируса гриппа и, если агрегаты не удалить (например, с помощью добавления ЭДТА) до анализа, можно получить ложные данные при исследовании образцов РНК с помощью метода скоростной седиментации. В большинстве случаев вирус-специфические РНК экстрагируют с помощью смеси фенол— хлороформ (1:1) в присутствии SDS (Penman, 1969) в буфере SLA.