IV. Химические свойства нейраминидазы

А. КОНСТАНТА МИХАЭЛИСА

Константа Михаэлиса (Км) отражает степень сродства фермента к субстрату и является параметром, который можно использовать для сравнения нейраминидаз, выделенных из различных штаммов. Величины Км для различных штаммов вируса гриппа при использовании в качестве субстрата М-ацетилсиалилла.ктозы (а, 2—>~3) равны: PR8 (N1) Км = = 1,0-Ю-3 М, оптимум рН 7,0; А2 (Япония)/305/57 (N2) Км = = 2,0-Ю-4 М, оптимум рН 6,5; FPV Км = 4,0-10^4 М, оптимум рН 6,0; B/Lee Км = 2,0-10~4 М, оптимум рН 6,8; данные суммированы в работе Gottschalk и Drzeniek (1972). Как величина Км, так и оптимальное значение рН являются субстрат-зависимыми величинами.

Используя синтетический субстрат МФН при рН 5,8, Sed-mak и Grossberg (1973) нашли, что величина Км для нейраминидазы штамма A0/NWS/39 (N1) равна 3,5 ■ 10—3 М, а для нейраминидазы, выделенной из A2/R 15+/57, Х7 и X7(F1) (N2), эта величина равна 6,5—6,9• 10~4 М, что указывает на пятикратное различие в сродстве к субстрату этих двух типов нейраминидаз. Как для сиалиллактозы, так и для МФН нейраминидаза типа N2 имеет в 5 раз большее сродство к субстрату, чем нейраминидаза типа N1. Однако абсолютное сродство Км обоих типов нейраминидаз к сиаллактозе в 3 раза ъыше, чем к МФН.

Б. ОПТИМУМ рН

Оптимальное для работы нейраминидазы вируса гриппа значение рН зависит от штамма вируса и используемого субстрата. В отличие от кислых значений рН, оптимальных для нейраминидаз бактерий и млекопитающих, аналогичные значения для нейраминидазы вируса гриппа обычно сдвинуты в щелочную сторону и более близки к нейтральным значениям рН. Kendal и Madeley (1969), используя в качестве субстрата сиалиллактозу, иашли, что для (большого числа штаммов вируса грдоша, включая штаммы вирусов гриппа АО, A1(N1), A2(N2), В, а также вируса А птичьего происхождения, оптимум рН лежит в пределах 6,4—7,0. Оптимальное значение рН зависит также от вида связи, расщепляемой ферментом. Schneir и Rafelson (1966) определили, что нейраминидаза (N2) расщепляет химическую связь (а, 2—>-3) с максимальной скоростью гари рН 6,5, в то время как та же нейраминидаза для расщепления связи (а, 2—>-6) имеет оптимальное значение рН 4,5. Однако максимальная скорость расщепления (а, 2—>-6) N-ацетилсиалиллактозы составляла, только 6% от аналогичной скорости для (а, 2—>-3) формы субстрата.

В. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТОМ РЕАКЦИИ

Нейраминидаза вируса гриппа 'конкурентно ингибируется. продуктом нейраминидазной реакции — N-ацетилнейрамино-вой кислотой, хотя для этого требуются относительно высокие концентрации нейраминовой кислоты. Walop и соавт. (1960), используя в качестве субстрата сиалиллактозу, определили Ки = 5,0-10-3 М для нейраминидазы штамма A2/57/Sing (N2). Rafelson и соавт. (1963b) для штамма PR8 (N1) определили Ки = 2-10^2 М и Ки=4-10-3 М для азиатского штамма при опти-мумах рН 7,0 и 6,5 соответственно. Это означает, что сродство нейраминидазы N2 к продукту реакции в 5 раз выше, чем аналогичная величина для нейраминидазы N1. Такое же соотношение существует между сродством Км нейраминидазы N2 н Ki к субстрату ферментативной реакции.

Г. ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И ПОТРЕБНОСТЬ В ИОНАХ КАЛЬЦИЯ

Хотя эти два свойства на первый взгляд кажутся совершенно независимыми, появляется все больше фактов, указывающих на их связь. Burnet и Stone (1947) показали, что нейраминидаза Vibrio cholerae имеет температуру инактивации на 8°С выше в (Присутствии ионов 2+Са, чехМ в их отсутствие. Сходный эффект был продемонстрирован для нейраминидазы вируса гриппа штамма B/Lee. Boschman и Jacobs (1965) обнаружили, что нейраминидаза штаммов FMl(Nl), А2 Япония (N2) и B/Joh резко повышают свою температурную чувствительность после обработки ЭДТА. Было, "кроме того, показано, что термостабильность и потребность в ионах .кальция меняются от штамма к штамму (Boschman, Jacobs, 1965; Dimmock, 1971). Нейраминидаза штамма АО(WSN) (N1) полностью теряет свою активность после прогрева в отсутствие Са2+ (Dimmock, 1971). Если же в растворе имелись Са2+, то 35% активности сохранялось. Ионы магния не могут заменить Са2+ для получения эффекта стабилизации. Действие Са2+ может быть обратным в присутствии ЭДТА.

Необходимость Са2+ для работы нейраминидазы, вне ее связи с фактором термостабильности, была предметом дискуссии в течение нескольких лет. Хотя повышение активности было налицо, трудно 'было показать абсолютную необходимость для работы фермента присутствия именно Са2+. Wilson и Rafelson (1967), удаляя ионы кальция с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом или с помощью добавления ЭДТА для полного связывания их следов, показали снижение на 20% активности нейраминидазы N2; максимальную активность можно получить, добавив 0,1 мМ Са2+. Почти абсолютная необходимость присутствия ионов кальция была показана Dimmock (1971) для нейраминидазы WSN(Nl). В отсутствие Са2+ ак~чвность нейраминидазы составляла около 1 % исходной активности, для получения максимальной активности требовалось 3 мМ Са2+. Нейраминидаза типа N2 (Япония) требовала для своей максимальной активности 0,3 мМ 2+Са. Та'ким образом, имеется десятикратное различие

в потребности в ионах 'кальция для нейраминидазы типа N1 и нейраминидазы типа N2. Особые трудности возникают при изучении действия малых (концентраций ионов кальция (особенно в случае нейраминидазы N2) в связи с тем, что 'большинство субстратов содержат двухвалентные ионы в количествах, достаточных для обеспечения потребности вирусной нейраминидазы (N2) в ионах кальция (Wilson, Rafelson, 1967).

В нескольких работах по изучению термостабильности было показано, что NA типа N1 относительно термолабильна, a NA типа N2 термостабильна. Rafelson и соавт. (1963а) показали, что нейраминидаза PR8(N1) полностью инактивиру-ется при нагревании до 55 °С в течение 30 мин, в то время как нейраминидаза азиатского штамма (N2) сохраняет 67% своей активности при аналогичной обработке. Paniker (1968) обнаружил, что термостабильность нейраминидазы вируса гриппа меняется в широких пределах. Штаммы A2(N2) обладают наиболее термостабильным ферментом, на активность которого не влияет нагревание в течение 1 ч при 45°С, а нейраминидаза штаммов NWS и WSE(Nl) наиболее термолабильна.