В. Перекрёстный способ определения групп крови системы ав0.

Это одновременное распознавание антигенов в эритроцитах исследуемой крови с помощью стандартных сывороток (цоликлонов) и выявление антител, содержащихся в сыворотке этой крови, с помощью стандартных эритроцитов.

Определение группы крови системы АВ0 стандартными эритроцитами

Необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови 0(I); А(II); В(III). Стандартные эритроциты группы 0(I) являются контрольными (в них нет антигеновАиВ). Стандартные эритроциты приготавливают на СПК из крови доноров с заранее известной группой крови; хранят при +4⁰+5⁰+ 6⁰С. Срок годности 2 года. Для определения группы крови, в пробирку берут 3 – 5 мл крови (без стабилизатора). Кровь должна отстояться или её центрифугируют для разделения на сыворотку и эритроциты. На тарелку наносят в три точки по одной большой капле (0,1мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними (соответственно маркировке) – по одной маленькой капле (0,01мл) стандартных эритроцитов групп 0(I), А(II), В(III).

Дальнейшие действия проводятся подобно определению группы крови стандартными сыворотками: соответствующие капли исследуемой сыворотки и стандартных эритроцитов смешивают отдельными стеклянными палочками (уголками предметного стекла), пластинку периодически покачивают и наблюдают за реакцией.

В те капли, где наступила агглютинация, но не ранее, чем через три минуты, добавляют по одной капле изотонического раствора, перемешивают и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения 5 минут. После чего оценивают результаты исследования.

Одновременно с вышеописанным исследованием со стандартными эритроцитами проводится исследование со стандартными сыворотками по ранее изложенному способу.

При определении групповой принадлежности крови перекрёстным способом оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными сыворотками и стандартными эритроцитами).Результат перекрёстного способа считается достоверным, если, при оценке результатов исследований со стандартными сыворотками и со стандартными эритроцитами, совпадают ответы о группе исследуемой крови.

Если этого совпадения не происходит, исследования следует вновь переделать.

Результаты реакций со стандартными эритроцитами				Сыворотка исследуемой крови содержит антитела	Исследуемая кровь принадлежит к группе
В(III)	А(II)		О(I)
эритроцитарный антиген В.	эритроцитарный антиген А.		В эритроцитах нет антигенов А и В.
+		+	-	анти – А и анти – В	О(I)
+		-	-	анти – В	А(II)
-		+	-	анти – А	В(III)
-		-	-	не содержит антител «анти –А» и «анти- В».	АВ(IV)

Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации;

Знаком минус (-) обозначено отсутствие агглютинации

3. Резус-фактор. Определение резус-принадлежности

В эритроцитах 85 % людей имеется особый антиген, названный Резус-фактором (антиген D). Такие люди считаются резус-положительными, а остальные 15%, не имеющие в крови Резус-фактора (антигена D), — резус-отрицательными. Резус-фактор (антиген D) передается по наследству как аутосомный доминантный признак.

В отличие от групповых агглютининов системы АВ0, в крови человека не содержится, подобных агглютининам α и β, естественных антител к Резус-фактору (антигену D). Их появление всегда связано с иммунизацией, т.е. попаданием в организм Резус-фактора (антигена D) . Самой частой причиной такой иммунизации является беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом, который унаследовал Резус-фактор (антиген D) от отца.

Антирезусные антитела могут вырабатываться также при ошибочном переливании резус-отрицательному реципиенту резус-положительных эитроцитов крови. При последующей такой гемотрансфузии может возникнуть тяжелое осложнение, связанное с резус-несовместимостью.

И, наконец, возможна искусственная иммунизация отобранных резус-отрицательных доноров-мужчин по специальной схеме малыми порциями резус-положительной крови. Такая иммунизация проводится для последующего получения от этих доноров антирезусной сыворотки. Таким образом, в отличие от групповых факторов системы АВ0, антитела к Резус-фактору (антигену D) всегда иммунные и требуют специальных методов для их выявления.

В настоящее время установлено, что помимо Резус-фактора существует около 40 родственных антигенов, объединяемых в систему антигенов DCE(илиRh-hr) — систему «Резус». Фактор С встречается у 70% людей, факторE- у 30%.

Резус-отрицательная кровь — это кровь, содержащая антигены системы Резус в таких количествах и разновидностях, которые не имеют существенного значения и не учитываются при переливании крови.

В эритроцитах резус-отрицательных людей имеются также факторы системы «резус», обозначаемые символами d, с, е. Факторы «С», «Е», «с» и «е» причиной трансфузионных реакций и осложнений бывают редко, причем последние чаще наблюдаются в акушерской практике. Их частота и тяжесть находятся в прямой зависимости от числа беременностей, родов, абортов и гемотрансфузий.

Наиболее частой причиной посттрансфузионных реакций и осложнений в системе «Резус» является антиген D: по своей антигенности (способности выработки антител) он занимает второе место после антигенов А и В.

Определение резус-принадлежности кровиявляется обязательным у всех доноров и больных, которым назначается гемотрансфузия, так же, как и определение группы крови системы АВ0. Оно проводится в лаборатории специалистом, прошедшим специальную подготовку, — лаборантом или врачом. Наиболее часто в лечебной практике используются два метода: определение резус-принадлежности в пробирке с помощью сыворотки (реагента) анти-D и реакция агглютинации на плоскости с помощью цоликлона анти-D (моноклональных анти-Dантител).

Определение резус-принадлежности в пробирке с помощью антирезусной сыворотки (сыворотки анти-D).Для этого метода используется стандартный универсальный реагент, представляющий собой сыворотку анти-D с добавлением 33 % полиглюкина в качестве коллоидной среды. Для исследования может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед использованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки. Допускается хранить образец крови до определения в холодильнике при температуре от +4 до +6 °С в течение 2 — 3 суток.

Методика проведения. Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят каплю стандартного универсального реагента анти-D, представляющего собой антирезусную сыворот­ку группы АВ (IV), содержащую 33% раствор полиглюки­на. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Наклоном и круговым вращением пробирки содержимое размазывают по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как прави­ло, в течение первой минуты, но для образования устой­чивого комплекса антиген — антитело и четкой агглюти­нации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 3 мл физиологического раствора и перемешивают путем 3-х кратного перевертывания про­бирки (без взбалтывания).

Оценка результатов. Пробирку просматривают на свет. Результат определяется по наличию или отсутствию агглютинации. Наличие агглютинации (круп­ные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Реакция агглютинации на плоскости с помощью цоликлонов анти-D.Используется специальный реагент, содержащий антитела к резус-фактору (цоликлон анти-D супер или аналогичные). На пластинку или планшет наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента, а рядом маленькую каплю (0,02 мл) исследуемых эритроцитов. Тщательно смешивают реагент с эритроцитами стеклянной палочкой (уголком предметного стекла). Через 10 — 20 секунд начинают мягко покачивать пластинку. Несмотря на то, что четкая агглютинация наступает почти мгновенно, результаты реакции учитывают через 3 минуты после смешивания. При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус-положительная, при отсутствии — как резус-отрицательная.

Подробные сведения по вопросу «Определение резус–принадлежности крови»

Определение резус–принадлежности крови больного заключается в выявлении в эритроцитах исследуемой крови антигена Rh_о(D). Из входящих в систему Резус шести основных эритроцитарных антигенов (D–d; С – с; Е – е) наиболее активным является антигенRh_о(D), который и подразумевается под термином «Резус–фактор». Именно по наличию или отсутствию антигена эритроцитовRh_о(D) делят реципиентов на резус–положительных и резус–отрицательных.

Для определения резус – принадлежности чаще используют два экспресс – метода.

А. Определение резус–принадлежности крови стандартным универсальным реагентом антирезус (анти - D) в пробирке без подогрева.

Этим универсальным реагентом является антирезусная сыворотка, лишённая групповых антител «анти–А» и «анти–В»; она пригодна для определения резус – принадлежности крови любой группы системы АВ0.