Определениефакторанекрозаопухолиα (tnf-α)

ДляизучениясодержанияTNF-αиспользованатест-системыроссийскогопроизводителя(«Протеиновыйконтур»,СПб.,Россия).СутьметодикиопределенияTNF-αосновананатвердофазномиммуноферментноманализе.

Исследуемыйобразец(гомогенатклеток)вколичестве50мклвносилив50мклинкубационногобуфераивыдерживалиприкомнатнойтемпературе2часа.Затемудалялисодержимоеячеекипромывали4раза.Добавлялибиотинилированныйконъюгатвобъеме100мклиинкубировали2часаприкомнатнойтемпературе.Послечетырехкратногопромываниядобавляли100мклстрептавидиновогоконъюгатаиспустя30минут100мклхромогенного

раствора.После30-минутнойинкубациидобавляли100мклстоп-раствораисчитывалиоптическуюплотностьпри450нм.

Радиоизотопныйметод

Стандартнымметодомдоклиническогоизученияфармакологическойактивностиглюкокортикоидовпослужилрадиоизотопныйметод,спомощьюкоторогоможносравнить количествомРНКвклетке.

Постановкарадиоизотопногометода

ИнтенсивностьбиосинтезамРНКвлимфоцитахоценивалиповключению³Н-клетоквРНКклетокпоследующейметодике.К0,5мл

клеточнойсуспензии(15×10⁶кл/мл)лимфоцитовдобавляли20мклрастворагормона(конечнаяконцентрацияпреднизолонавпробах10⁻⁶М),послечего

клеткиинкубировалипритемпературе37Свтечение4часов.Вконтрольныхпробахклеткиинкубировалибезстероида.Через24часавкаждуюпробиркувносилипо2мкКи³Н-уридинавобъеме10мкл.(Удельнаярадиоактивность³Н-уридина5мкКи/ммольв1мл).Пробыинкубировалиеще1час,затемпробиркиохлаждалидо4Сицентрифугировали(3000g,10мин).Косадкудобавляли3мл5%растворапредварительноохлажденнойдо4Стрихлоруксуснойкислоты(ТХУ).Полученнуюсуспензиюцентрифугировали(3000g,10мин)идваждыотмывалив3млраствораТХУ(образующийсяврезультатематериал(осаждаемыйТХУ)состоитизпреципитированной³Н-уридин-РНК).Полученныйпослецентрифугированияосадокпереносиливофлаконыдляопределениясодержаниямеченогоуридинаметодомжидкостнойрадиометрии.

Жидкостнаясцинтилляционнаярадиометрия

Восновеметодалежитсвойствобета-частицвызыватьсцинтилляциювеществвспециальныхсредах.Этодаетвозможностьсбольшойэффективностьюрегистрироватьбета-излучение,обладающеемалойэнергией.

Длярегистрациирадиоактивностиобразецнафильтрепомещалив5млсцинтилляционнойжидкости.Еесостав:РРО(2,5-дифенилоксазол)-4г,

РОРОР(1,4-бис-2-метил-5-фенилоксазолилбензол)-0,4г,толуол-до1литра.СмесьтщательноперемешивалиирадиоактивностьобразцарегистрировалинажидкостномсцинтилляционномрадиометреPerkinElmerTri–Carb3110(ПроизводительСША).Эффективностьсчетадля³Нсоставляла50-55%.

Радиоактивностьизмеряливколичествераспадоввминуту(dpm),учитываяэффективностьсчетадляданногосчетчика,т.к.количествовспышек(cpm)будетменьшедлятакойрадиоактивнойметкикактритий.

2. Статистическаяобработкарезультатовисследования

Результатыисследованиябылиполученынакафедремолекулярнойфармакологииирадиобиологиироссийскогонаучно-исследовательскогомедицинскогоуниверситета им.Н.И. Пирогова.

Статистическийанализполученныхрезультатов,полученныхподвумгруппамбольныхпроводилиспомощьюпрограммыExcel;вычислялисредниезначенияпонесколькимизмерениям,погруппеСР(-)пациентовнаходилимедиануиинтервалзначений.

ДляопределениястатистическизначимыхотличиймеждугруппамибольныхиспользовалсяинтервалзначенийпоСР(-)пациентам.ПолученныерезультатыпогруппеСР(+)больных,которыеневходиливинтервалзначенийпроверялисьнастатистическуюзначимость(р<0,05)различиймеждугруппамиСР(+)иСР(-)пациентовспомощьюнепараметрическогокритерияМанна-Уитнидлянебольшойвыборки.