Оборудование

СистемаопределенияПЦРврежимереальноговремени«iCyclerIQ5»(«Bio-Rad»,CША),

Жидкостной сцинтилляционный анализатор «Tri-Carb 3110 TR»(«PerkinElmer»,США),

Центрифуга сбакет-ротором«5804R» («Eppendorf», Германия),

Ареометрспределамиизмеренийот1.060г/см³до1.090г/см³«ASTM120H» («Amarell», Германия),

КамераГоряева(«ОООМинимед», Россия),

Микроскоп«СХ31»,(«Olympus», Япония),

Ламинарный бокс («Ламинарные системы», Россия, классбиологическойбезопасностиIIтипА),

Термостатдляпробироктипа«Эппендорф»от25до100°С«Гном»(«ДНК-Технология»,Россия),

Центрифуга типа«Vortex»«MicrospinFV-2400» («Biosan», Россия),

Микроцентрифугадляпробироктипа«Эппендорф»до16тысячg(«Eppendorf», Германия),

Сцинтилляционныефлаконы(«GreinerBio-One», Австрия).

Изучениехарактерасвязываниясмембраннымирецепторамипо

стандартнойметодике

Выделениелимфоцитов

Упациентовпроводилсязаборпериферическойкровиизлоктевой

вены.

0,2млсуспензииклеток(10-2010^{6клеток/мл)}инкубировалипри4⁰Свтечение1часавприсутствии¹⁴С-ПВП-преднизолона.Данныйполимерныйаналогстероиданепроникаетвнутрьклеткиисвязываетсятолькосмембраннымиструктурами.Концентрациявсредеинкубациисоставляла2,510^-6М.Дляопределениянеспецифическогосвязываниявпробы(дубли)с¹⁴С-ПВП-ГКвносили1000-кратныйизбытокнемеченогосвободногогормонапреднизолона.ДалеесодержимоепробпереносилинафильтрыGF/C"Whatman"идваждыотмывали5млHEPES-буфера(t=4C).Послевысушиванияфильтрыпомещаливсцинтилляционныефлаконыдля

последующейрадиометрии.

Количествоспецифическихместсвязываниянаплазматическоймембранеопределялисучетомэффективностисчета(50-60%)иудельнойрадиоактивности(5Ci/ммоль)¹⁴С-ПВП-аналогов.Специфическоесвязываниевычисляликакразницумеждуколичествомсвязанныхклетками

полимероввотсутствиинемеченыхгормонов(общеесвязывание)иколичеством¹⁴С-ПВП-аналогов,связанныхклеткамивприсутствии1000-кратногоизбытканемеченыхсвободныхгормонов(неспецифическое

связывание).

Исследование связывания меченого сгк внутриклеточными

рецепторамипометодикеLippman

0,2млсуспензииклеток(10-2010^{6клеток/мл)}инкубироваливтечениечасапри4⁰Свприсутствии³Н-преднизолона(конечнаяконцентрация20нМ):безпрепарата(контроль)ивприсутствии100-кратногоизбытканемеченогоаналогагормона.Анализсодержаниявнутриклеточных

рецепторовпроводилипометодикеLippman(1978).Ксуспензииклетокдобавлялидигитонинвконечнойконцентрации50мкМ,которыйвызывалразрушениемембраны.Дляопределенияцитоплазматическогосвязывания

³Н-гормонаотбиралиаликвоты(20мкл)суспензииклетокипереносилиихв

пробирки,содержащие100 мкл1,5мМMgCl_2врастворедекстран-покрытогоугля,тщательноперемешивалииоставлялина15минут.Далеепробыцентрифугировали(15000g,10мин)исупернатант радиометрировали.

Результаты,получаливколичествевспышеквсекунду(измеренияпроводилисьпотриплексам),которыепереводиливколичествоместсвязываниясучетомудельнойрадиоактивностиметкииэффективностисчетаприбора.

Полимеразно-цепнаяреакцияврежимереальноговремени

Дляопределенияα-иβ-изоформГРиспользовалиметодПЦРврежимереальноговремени.

Описаниеметода:

1. ВыделениеРНК.

ТотальнуюРНКэкстрагировалиизклетоксиспользованиемкомплектареагентовдлявыделенияРНК/ДНКизклиническогоматериала«Рибо-препвариант100» поинструкциипроизводителя:

1. «Раствордлялизиса»прогревалипри65ºСдополногорастворениякристаллов.

2. Встерильныеодноразовыепробиркивносиликлеточнуюсуспензию,центрифугировали3минпри3тыс.об/мин.Надосадочнуюжидкостьсливалиспомощьюмикропипетки.Добавляливпробиркипо300мкл

«Раствордлялизиса».

3. Содержимоепробирокперемешивалинацентрифугетипа«Vortex»ипрогревали5минпри65ºСвтермостате.

4. Впробиркидобавлялипо400мкл«Раствордляпреципетации»,перемешивалинацентрифугетипа«Vortex».

5. Центрифугировалипробиркинамикроцентрифуге5минпри13тыс.об/мин.

6. Аккуратноотбиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникнамикропипеткудлякаждойпробы.

7. Добавляливпробиркипо500мкл«Раствордляотмывки3»,плотнозакрываликрышкииосторожнопромывалиосадок,переворачиваяпробирки3-5раз.

8. Центрифугировалипри13тыс.об/минвтечение2миннамикроцентрифуге.

9. Аккуратноотбиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникнамикропипеткудлякаждойпробы.

10. Добавляливпробиркипо200мкл«Раствордляотмывки4»,плотнозакрываликрышкииосторожнопромывалиосадок,переворачиваяпробирки3-5раз.

11. Центрифугировалипри13тысячоборотов/минвтечение2миннамикроцентрифуге.

12. Осторожноотбиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникна10мклдлякаждойпробы.

13. Помещалипробиркивтермостатпритемпературе65ºСна2миндляподсушиванияосадка(крышкипробирокдолжныбыть открыты).

14. Добавляливпробиркипо50мклРНК-буфера.Перемешивалинацентрифугетипа«Vortex».Помещаливтермостатпри65ºСна5мин,периодическивстряхиваянацентрифугетипа«Vortex».Центрифугировалипробиркипри13тысячоборотов/минвтечение1мин намикроцентрифуге.НадосадочнаяжидкостьсодержиточищенныеРНКиДНК(отбираливчистыемикропробирки).

2. Реакцияобратнойтранскрипции.

ДлявыделениякДНКисследуемыхгеновиспользовалислучайныегексонуклеотиды-праймеры(последовательностьиз6-титриплетовнуклеотидов).Таккак,гексонуклеотиды,неспецифическисвязываясьна

мРНК,нарабатываютнебольшие(короткие)перекрывающиесякДНКпрактическиповсейматрицемРНК,тоимиможноэффективноизучатьвсюпоследовательностьмРНК.

Отжиг(гибридизацию)праймеровпроводилипритемпературе70°Свтечение5минут,инкубируямРНКобразца(30мкл),эквимолярнуюсмесь4-хнуклеотидов(12мкл),праймеры-гексамеры(1,5мкл);доводиливодойобъемсмесидо75мкл.Наэтомэтапепраймеры«находят»комплементарныеучасткивисследуемойРНКигибридизуютсясними.Затемпроводилиреакцию обратнойтранскрипцииспомощьюнабора«РЕВЕРТА-L».

ВсоставнаборавходитRT-G-mix-1,RT-mix,ревертаза(MMLV),ДНК-буфер.

Порядокпостановкиреакции:

1. Приготовилиреакционнуюсмесьна12реакций.Дляэтоговпробиркус RT-mixвнесли5мклRT-G-mix-1,тщательноперемешалинацентрифугетипа«Vortex»,осадиликаплискрышкипробиркикратковременнымцентрифугированием.

2. Кполученномурастворудобавили6мклревертазы(MMLV),пипетировали5 раз,перемешатьнацентрифугетипа«Vortex».Осадиликапли скрышкипробиркикратковременнымцентрифугированием.

3. Внесливмикропробиркипо10мклготовойреакционнойсмеси.

4. Используянаконечниксаэрозольнымбарьером,добавилипо10мклРНК-пробывпробиркисреакционнойсмесью.Осторожноперемешалипипетированием.

5. Поставилипробиркивтермостатстемпературой37ºСна30минут.

6. ПолученнуювреакцииобратнойтранскрипциикДНКдляпоследующейпостановкиПЦРразвелив2разаДНК-буфером(к20мклкДНКотдельнымнаконечникомсаэрозольнымбарьеромдобавили20мклДНК-буфера, аккуратноперемешалипипетированием10раз).

3. РеакцияПЦР-РТ.

ДляпостановкиПЦР-РТиспользовали«НаборреактивовдляпроведенияПЦР-РТвприсутствииинтеркалирующегокрасителяSYBRGreenI»,содержащий:реакционнуюсмесь(ПЦРбуферВ-KCl,ТрисHCl(рН8,8),6,25мМMgCl₂;TaqДНК-полимераза;дезоксинуклеозидфосфаты;глицерол,Tween20,интеркалирующийкрасительSYBRGreenI),25мМMgCl₂,деионизированнуюводу.

Таблица7.РТ-ПЦРсупермиксна22пробы.

SYBRGreenI	H20	MgCl2
220мкл	165мкл	33мкл

Таблица8.Праймер-миксна22пробы.

Прямойпраймердетектируемого гена	Обратныйпраймердетектируемого гена
44мкл	44мкл

Таблица9.ПостановкаПЦР-РТ.

Количествопроб	РТ-ПЦР супермикс	Праймер-микс	кДНК(полученнаяна2этапе)
1проба (микропробирка)	19мкл	4мкл	2мкл

Вреакциииспользовалисьспецифическиепраймерыкэкзону1генаNR3C1:

ПрямойпраймерГРα:ATCACTTTCACTTCTGCTGG;ПрямойпраймерГРβ:GCCGGCACGCGACTCC;

ОбратныйпраймерГРα/ГРβ:CAGTGGATGCTGAACTCTTGG.

ДляпостановкиПЦР-РТиспользуютследующиеэкспериментальныепротоколы:

1.ПрограммадляамплификациикДНКГРα

1. ДенатурацияматричнойДНК–3мин.,94ºС

2. Денатурация–30сек.,94ºС

3. Отжигпраймеров–90сек.,60ºС

4. Элонгация–30сек.,72ºС

5. Финальнаяэлонгация–10мин.,72ºС

2. ПрограммадляамплификациикДНКГРβ

   1. ДенатурацияматричнойДНК–3мин.,94ºС

   2. Денатурация–30сек.,94ºС

   3. Отжигпраймеров–30сек.,60ºС

   4. Элонгация–30сек.,72ºС

   5. Финальнаяэлонгация–10мин.,72ºС

40циклов

40циклов

ОценкасодержаниямРНКобразцовпроводиласьполуколичественнымметодом.Относительнаяконцентрациявычисляласькакотношениеуровняэкспрессииисследуемогогенакгену«домашнегохозяйства».ВданномэкспериментевкачестветакогогенавыступалGAPDH.СинтезмРНКгенов

«домашнегохозяйства»осуществляетсявклеткахпостоянно,иуровеньмРНКвсегдастабиленвразличныхтканях,дажепослеэкспериментальнойинкубациисразличнымиактивнымивеществами.

Прииспользованиивыбраннойметодикинеобходимоопределениефлуоресценциив«threshold»точке(crosspoint(CP))длякаждогогена.СРопределяетсякакточка,гдеподъемкривойфлуоресценцииампликоновисследуемогогеназначительновыше,чемфоновоесвечение.Количественнаяоценкавсегдаосуществляетсяв«экспоненциальную»фазу,таккакоценкавфазу«плато»считаетсянеэффективнойиз-занарастающегоистощениякомпонентовреакционнойсмеси.Даннаяточкахарактеризуетномерцикла,накоторомнакапливаетсяминимальноеколичествоспецифическогопродукта,уровеньфлуоресценциикотороговышефонового(рисунок12).

СP

Порог

Рисунок12.Графическоепредставлениепроцессанакопленияампликонов.

Вычисленияконечныхзначенийпроизводилисьспомощью«дельта-метода»:находиласьразницамеждупороговымцикломисследуемогогенаигена«домашнегохозяйства»,такимобразомвычислялосьпроцентноесодержаниеисходноймРНКопытногообразцаотносительномРНКгена

«домашнегохозяйства».