2. Исследование молекулярных механизмов стероиднойрезистентности напострецепторномуровне

ОбъектомисследованияпослужилагруппапациентовсоСР(-)(n=10)иСР(+)формамиИАП(n=14).

Реактивы

Вработеиспользовалисьследующиереактивы:фиколл-400–полисахарид(«ДНК-Технология»,Россия),уротраст-рентгеноконтрастноевещество(«ДНК-Технология»,Россия),среда199(«ППБВПРАМН»,Россия),стерильнаядистиллированнаявода,3%растворуксуснойкислоты,[³Н]-уридин(5мкCi/ммоль)(«ИВСРАН»,Санкт-Петербург),преднизолон(«Merck»,Германия),дигитонин(«ЗАОАлтайвитамины»,Россия),HEPES-буфер(«Applichem»,Германия),фура-2/АМ("Calbiochem");дигитонин,ЭДТА,мембранныефильтрыGF/C(«Whatman»,Великобритания),комплектреагентовдлявыделенияРНК/ДНКизклиническогоматериала«Рибо-препвариант100»(«ФГУНЦНИИЭРоспотребнадзора»,Россия),комплектреагентов«РЕВЕРТА-L»дляпроведенияреакцииобратнойтранскрипции»(«AmpliSensbiotechnologies»,Россия),«НаборреактивовдляпроведенияРТ-

ПЦРвприсутствииинтеркалирующегокрасителяSYBRGreenI»(«Синтол»,Россия).

Оборудование

• ПриборПЦРврежимереальноговремениIsycleriq5(США),PerkinElmerTri–Carb3110(ПроизводительСША),

• СпектофлюориметрMPF-4"Hitachi"(Япония),

• Центрифуга типа «Vortex» «Microspin FV-2400» («Biosan»,Россия),

• Центрифугасбакет-ротором,5804R(«Eppendorf», Германия),

• Ареометрспределамиизмеренийот1.060г/смдо1.090г/смASTM120H(«Amarell», Германия),

• КамераГоряева(«ОООМинимед», Россия),

• МикроскопСХ31,(«Olympus»,Япония),

• Ламинарныйбокс(«Ламинарныесистемы», Россия),

• Термостатдляпробироктипа«Эппендорф»от25до100°С «Гном»(«ДНК-Технология»,Россия),

• Микроцентрифугадляпробироктипа«Эппендорф»до16тысg(«Eppendorf», Германия),

• Сцинтилляционныефлаконы(«GreinerBio-One», Австрия).

Приготовлениереактивов

1. Приготовлениефиколла:4,32гпорошкафиколла-400растворялив48млдистиллированнойводы.

2. Приготовлениерастворарентгеноконтрастноговещества(урографина):10,14мл75%раствораурографинадоводилидистиллированнойводойдо21мл.

3. Приготовлениеградиентаплотности:растворыфиколлаиурографинасмешивали.Спомощьюареометраизмерялиплотностьполученногораствора,котораядолжнасоставлять1,077г/см.Еслиплотностьвыше,чемнеобходимо,тодобавлялирастворфиколла,еслиниже–растворурофагина.Градиент

плотностиможнохранитьвтечение30сутокпритемпературе+4всклянкеизоранжевогостекла.

4. Выделениелимфоцитов:периферическуюкровьизлоктевойвенывобъеме10млбраливпробирку,содержащуюгепарин,вконечнойконцентрации25едв1млкрови.Кровьдолжнабылаотстоятьсявтечение40-60минприкомнатнойтемпературедочеткогоразделенияэритроцитови плазмы.

4а.Вцентрифужнуюпробиркуналивали2-3млградиентаплотности,нанегонаслаивали4-6млотстоявшейсяплазмыиверхнийслойэритроцитов.Соотношениеобъемов градиент:плазмувыдерживаливпределах1:2–1:4.

4б.Пробиркицентрифугироваливтечение40минвбакет-роторесускорением200g(1500-1800об/мин)притемпературе20°С.Впроцессецентрифугированияэритроцитыигранулоциты«проваливались»вградиентиоседалинаднопробирки.Наверхнейграницеградиентаприправильномразделенииобразовывалосьрыхлоекольцобеловатогоцвета,состоящеевосновномизлимфоцитовспримесьюмоноцитов.Надслоемлимфоцитовнаходитсяплазма.Плазмусобираливотдельнуюпробиркудляпоследующегоанализанаиммуноглобулины;лимфоцитыотсасываливсухуюконическуюцентрифужную пробирку.

4в.Ксуспензиилимфоцитовдобавляли3-4млсреды199исодержимоепробиркитщательноперемешивали.Послеэтогопробиркицентрифугировалисускорением200-300gпритемпературе20°С,затемнадосадочнуюжидкостьудаляли,апроцедуру отмывкиповторялиещеодинраз.

4г.Послеотмыванияк0,1млосадкаотмытыхклетокдобавляли0,9млсреды199,суспензиютщательноперемешивали;вчистуюпробиркувносили0,38мл3%растворауксуснойкислотыи0,02млвзвесилимфоцитов;вкамереГоряеваподсчитывалилимфоцитыв100большихквадратахиполученноечислоумножалина50000.Результатсоответствовалколичествулимфоцитовв1млсуспензии.Готовуюсуспензиюлимфоцитовхранилипри4°Свтечении2часов.