Параметри температурних циклів

ПЛР передбачає інкубацію зразків при трьох температурах, які відповідають трьом етапам циклу ампліфікації – денатурації, відпалу, добудові.

Звичайно длДНК денатурують шляхом короткочасного нагрівання зразку до 90-95С,

потім проводять відпалювання, охолоджуючи зразок до 40-60С (в залежності від довжени праймера та вмісту ГЦ пар). Цю температуру можливо оцінити за формулою:

4˚С х (Г+С) +2˚С х (А+Т)-3).

За рахунок великого надлишку затравок в реакційній суміші гібридизація відбувається майже миттєво та не вимагає довгої інкубації при температурі відпалювання.

Далі суміш нагрівають до 70-75˚С для синтезу (добудови) затравок. Оптимальна температура для роботи Tag-полімерази – 72С. Час інкубації при цій температурі залежить від довжини ділянки, що ампліфікується (вважається, що Tag -полімераза синтезує послідовність в 1000 нуклеотидів за 1 хв.)

Аналіз плр-ампліфікованої днк

Для аналізу продукту, отриманого в ПЛР, використовують різні методи, такі як: гель-електрофорез, дот-блот-гібридизацію та блот-гібридизацію за Саузерном. З їх допомогою можливо аналізувати більшість ПЛР-продуктів, але абсолютно достовірні результати можливо отримати тільки сіквенуванням.

Частіше всього для швидкої візуалізації результатів ПЛР використовують гель-електрофорез в агарозному гелі за загальноприйнятими методиками.

Більшість вірусів рослин, а також віруси тварин є РНК вмісними. Чи можливе вивченя НК таких вірусів та ампліфікація ділянок НК?

Так, можливе, з використанням попередньо отриманої її кДНК копії (за допомогою ферменту зворотньої транскриптази – РНК-залежної-ДНК-полімерази). Але це набагато складніший процес, оскільки РНК менш стабільна, ніж ДНК. Для діагностики та вивчення РНК-вмісних вірусів користуються методом ЗТ-ПЛТ (RT-PCR). Модифікації можуть бути найрізноманітніші - від попереднього синтезу кДНК з подальшим ампліфікуванням в різних пробірках, до RT-PCR в одній пробірці, що значно спрощує дослідження та підвищує їх чутливість.

Виявлення та детекція віроідів ті вірусоїдів відбувається за допомогою ПЛР, оскільки це – єдина реакція, за допомогою якої можливе швидке та специфічне їх визначення.

Real-time pcr (прл у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях.

ПЛР в молекулярній діагностиці широко використовується для детекції нуклеїнової кислоти з будь-яких організмів та займає найважливіше місце в інструментарії дослідницьких лабораторій. Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) походить зі звичайної ПЛР, використовуючи її швидкість, чутливість, повторюваність, при цьому зменшуючи ризик зовнішньої контамінації. В теперішній час використовується 5 хімічних речовин для детекції ПЛР- продуктів протягом real-time PCR. Ці речовини : ДНК зв’язуючі флюорофори, 5’ендонуклеази, суміжні лінійні та булавковидні (hairpin oligoprobes) олігопроби, флюоресціюючі амплікони, які вивчені детально.

Моніторинг акумуляції ампліконів в реальному часі став можливим завдяки міченню праймерів, проб або ампліконів з флюорогенними молекулами. Цей підхід має переваги над радіоізотопними олігопробами, які обов’язково включають радіактивне випромінення.

Швидкість Real Time PCR підвищується за рахунок зменшення часу циклів, відміни пост-ПЛР детекції та використання флуоресцентних міток і чутливих методів детекції їхнього випромінення. Редукція в розмірі ампліконів може також впливати на швидкість реакції, але зменшення розміру продукту не є необхідним для поліпшення точності ПЛР .

Недоліки вживання Real Time PCR в порівнянні з конвенційним ПЛР включають нездатність моніторингу розміру амплікону без входу в систему, несумісність деяких матриць (детекруємих ДНК) з деякими хімічними флюорогенами та високу собівартість аналізу.

Контрольні запитання.

1. З якою метою використовують ПЛР у вірусологічних дослідженнях?

2. Що можливо виявити за допомогою ПЛР?

3. Температурні режими при постановці ПЛР.

4. Основні компоненти полімеразної ланцюгової реакції.

5. Теоретичне обгрунтування можливості постановки ПЛР.

6. Модифікації ПЛР.

7. Виявлення ділянок вірусної РНК за допомогою ПЛР.

8. Чи можливо виявити за допомогою ПЛР пріони?

9. Переваги та недоліки використання ПЛР у реальному часі.

10. Порівняння ПЛР з іншими методами детекції ДНК.

Література.

1. Анализ генома. Методы. Под ред Дейвиса К.- М.:Мир.- 1990.-С. 176-191.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.- М.: Мир.-2002.-С.181-204.

3. Мюллис К.Необычайная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция// В мире науки.- №6.- 1990.-С.26-34.

4. Molecular methods for virus detection/ Ed. By Danny L. Wiedbrauk.- Academic Press.- 1995.-350p.

5. Molecular biology of plant viruses/ Ed. by C.L.Mandahar.- Kluver Academic Rublisher, USA.-281p.

ДОДАТОК 1