Внутрішньоклітинні включення

При багатьох вірусних інфекціях в клітинах (в ядрі чи цитоплазмі) різних органів та тканин з’являються особливі утворення, які називають тільцями-включеннями. Їх класифікують за локалізацією в клітині, вмістом нуклеїнової кислоти, тинкторіальними властивостями та гомогенністю (гомогенні чи зернисті).

Тільця-включення локалізуються вибірково. Так, цитоплазматичні включення характерні при віспі (тільця Гварнієрі), сказі (тільця Бабеша-Негрі) (рис.14.a. (кольорова вклейка)), грипі, парагрипі, чумі великої рогатої худоби та ін. При ринотрахеїті великої рогатої худоби, ларинготрахеїті птахів, аденовірусній інфекції(рис.14.b. (кольорова вклейка)), герпесвірусній інфекції (тільця Каудрі), ящурі розвиваються включення в ядрі.

По відношенню до барвників включення поділяють на базофільні (фарбуються основними барвниками – азур, піроксин) та ацидофільні або оксифільні включення (фарбуються кислими барвниками – еозин, кислий фуксин).

За своєю природою включення можуть бути місцями утворення вірусних часток (фабрики віріонів – тільця Гварнієрі), скопиченням вірусів (тільця Бабеша – Негрі, поліедри), глибками хроматину (тільця Каудрі).

Титрування вірусів у одношарових культурах клітин

У лабораторних роботах з вірусами, біофабричному виробництві та у медичній і ветеринарній практиці постійно виникає необхідність визначення кількості вірусів у тому чи іншому матеріалі. Без такого визначення неможливе контрольоване експериментальне ураження вірусами лабораторних тварин, виробництво живих та інактивованих противірусних вакцин та діагностичних препаратів, оцінка активності живих противірусних вакцин, отримання імунних сироваток та багато інших завдань.

Кількість вірусу в будь-якому матеріалі визначають за титром вірусу в цьому матеріалі. Під титром вірусу розуміють вираження його концентрації у матеріалі. Титр вірусу – це кількість вірусу, яка міститься в одиниці об’єму матеріалу.

Титрування вірусів та антитіл до них в одношарових культурах клітин проводиться наступними методами: за ЦПД, методом кольорової реакції (відбувається зміна забарвлення у жовтий колір середовища під впливом продуктів метаболізму неуражених клітин, в той час як у тканинній рідині заражених вірусами клітин зберігається вихідний колір середовища - червоний), методом бляшок (рис.15 (кольорова вклейка)), у реакції гемадсорбції (рис.16 (кольорова вклейка)). Оскільки кількість вірусу неможливо виразити у звичайних одиницях об’єму, маси та ін., застосовують вимір одиниць дії чи одиниць активності (інфекційні, гемаглютинуючі, бляшкоутворюючі одиниці). У випадку прояву інфекційної активності вірусу у вигляді утворення бляшок кількість вірусу може бути виміряна у бляшкоутворюючих одиницях (БУО). 1 БУО – те найбільше розведення вірусу, яке в культурі клітин здатне утворити 1 бляшку.

Для визначення титру вірусу в БУО декілька культур клітин у матрасах заражують точно відміряними однаковими об’ємами дослідного вірусвмісного матеріалу. Потім вираховують, скільки бляшок утворилося в кожному з них і розраховують середнє арифметичне цієї кількості. Воно дорівнює кількості БУО, яке міститься в дозі вірусмісного матеріалу, що вносили в культуру.

T = n/(V x a),

де n – середнє арифметичне кількості бляшок на один матрас; V – об’єм вірусвмісного матеріалу, який вносили в культуру; a - розведення вірусвмісного матеріалу, яке використовували для зараження.

Цей приклад титрування вірусу – спрощений, оскільки він не враховує випадків високої концентрації вірусу в матеріалі, при якій бляшки в культурі клітин можуть зливатися між собою і їх буде важко порахувати. Вважається, що підрахуванню піддаються бляшки, якщо їх кількість не перевищує 50 на матрас. Тому готують декілька розведень досліджуваного матеріалу (звичайно з коефіцієнтом 10) і кожним розведенням в однакових дозах заражують рівні групи культур клітин. Після цього розраховують середнє арифметичне кількості бляшок для кожного розведення, відкидаючи ті, де підрахунок виявився неможливим. Титр вірусу тоді розраховують за формулою

T = (n₁ + n₂ + n₃ +… + n_n) / (V x (a₁ + a₂ + a₃ + … + a_n),

де n – середнє арифметичне кількості бляшок на один матрас; V – об’єм вірусвмісного матеріалу, який вносили в культуру; a - розведення вірусвмісного матеріалу, яке використовували для зараження.

Титрування вірусу в пробірочних культурах передбачає визначення 50% інфекційної дії (за одиницю кількості вірусу приймається така його доза, яка здатна викликати ефект у 50 % заражених тест-об’єктів, ЕД₅₀). Прикладом ЕД₅₀ може бути ЦПД₅₀ (доза вірусу, яка викликає появу цитопатичного ефекту у 50 % заражених клітин в культурі).

Розрахунок дози (розведення) вірусу, яке дає 50%-ий ефект, може бути проведений таким чином:

а) за Рідом та Менчем

lg ЕД₅₀ = lg B – [(b - 50)/ (b - a)] x lg d,

де ЕД₅₀- розведення вірусу, що розраховується; В – розведення, яке дає ефект більше 50 %; b – відсоток, який відповідає розведенню В; а – відсоток, який відповідає розведенню, що дає ефект менше 50 %; d – коефіцієнт розведення.

b) за Кербером

lg ЕД₅₀ = lg D + lgd/2 – lgd Σ (r/n),

де D – найбільше розведення вірусу, яке ще дає 100% - ий ефект; d – коефіцієнт розведення; Σ (r/n) – сума відношень позитивно реагуючих тест-об’єктів до заражених для усіх розведень, що дають ефект від 0 до 100%; r – кількість позитивно реагуючих тест-об’єктів на кожне розведення; n – кількість заражених тест-об’єктів на кожне розведення.