- •Розділ 1. Організація вірусологічних лабораторій.
- •Обладнання вірусологічних лабораторій
- •Правила роботи в учбових вірусологічних лабораторіях
- •Практична частина
- •Контрольні питання та контрольні завдання
- •Література
- •Тема 1: Використання лабораторних тварин у вірусологічних дослідженнях
- •Природні інфекційні хвороби деяких лабораторних тварин, збудники яких є патогенними для людини
- •Індикаторні тварини
- •Гнотобіотичні тварини
- •Показники мікроклімату в приміщеннях для лабораторних тварин
- •Густота посадки в клітках лабораторних тварин та птахів
- •Причини канібалізму та заходи його профілактики
- •Основні показники нормальної життєдіяльності різних видів тварин
- •Зв’язок тропізму вірусу зі способом ураження чутливого організму та видом патологічного матеріалу
- •Допустимі дози досліджуваного матеріалу, що вводиться лабораторним тваринам, мл
- •Методи зараження через травний тракт
- •Перкутанне (нашкірне) зараження
- •Кутанне (шкірне) зараження
- •Субкутанне (підшкірне) зараження
- •Інтракутанне (внутрішньошкірне) зараження
- •Інтравенозне (внутрішньовенне) та інтракардіальне (внутрішньосерцеве) зараження
- •Інтрамускулярне (внутрішньом’язеве) зараження
- •Інтраперітонеальне (внутрішньочеревинне) зараження
- •Субокципітальне (каркове) зараження
- •Інтрацеребральне (внутрішньомозкове) зараження
- •Зараження в периферичний нерв
- •Інтратестикулярне (внутрішньосім’яникове) зараження
- •Інтраокулярне зараження
- •Корнеальне зараження
- •Інтракорнеальне зараження
- •Кон’юнктивальне зараження
- •Забір крові
- •Антикоагулянти
- •Лабораторне заняття
- •Тема 2. Курячі ембріони та їх використання у вірусології
- •Теоретична частина
- •Практична частина
- •Будова курячого ембріону
- •Практична частина Лабораторне заняття
- •Тема 3. Клітинні культури у вірусології
- •Теоретична частина
- •Класифікація тваринних культур клітин
- •Одношарові культури клітин
- •Чутливість первинних культур клітин до вірусів людини
- •Характеристика деяких із відомих клітинних ліній
- •Переваги та недоліки використання постійних культур клітин
- •Чутливість постійних клітинних культур до вірусів
- •Суспензійні культури клітин
- •Зберігання культур клітин
- •Умови культивування клітин in vitro
- •Поживні середовища
- •Середовище 199 (Морган, Мортон, Паркер; 1950 р.)
- •Контамінація культур клітин
- •Взаємодія вірусів із клітинами
- •Методи виявлення та ідентифікації вірусів у клітинних культурах
- •Цитопатична дія
- •Внутрішньоклітинні включення
- •Титрування вірусів у одношарових культурах клітин
- •Практична частина Лабораторне заняття
- •Хід роботи
- •Контрольні завдання
- •Контрольні запитання
- •Література
- •Розділ 3. Віруси бактерій
- •Теоретична частина Загальна характеристика вірусів бактерій
- •Практична частина Методи титрування бактеріофагів
- •Титрування фагу за методом Аппельмана (рідке середовище)
- •Хід роботи:
- •Практична робота: Виділення фагів із лізогенних культур
- •Розділ 4. Дослідження вірусів рослин
- •Теоретична частина
- •Практична частина
- •Тема. Способи передачі вірусів рослин. Рослини-індикатори.
- •Практична частина Лабораторне заняття
- •Тема. 2. Виділення, очистка та концентрування вірусів рослин
- •Практична частина
- •Теоретична частина
- •Розділ 5. Використання електронної мікроскопії у вірусологічних дослідженнях.
- •Практична частина Хід роботи
- •Розділ. 6. Методи діагностики вірусних інфекцій та ідентифікації вірусів
- •Тема 1. Серологічні методи досліджень
- •Теоретична частина Реакція гемаглютинації
- •Імунологічні методи дослідження
- •Імунодифузійні тести.
- •Радіоімунологічний аналіз (ріа)
- •Імунофлуоресцентний аналіз (іф)
- •Імуноферментний аналіз
- •Практична частина Практична робота №1
- •Хід роботи
- •Практична робота №2
- •Хід роботи
- •Список літератури
- •Тема 2. Застосування полімеразної ланцюгової реакції у вірусологчних дослідженнях
- •Обладнання для плр
- •Компоненти реакції.
- •Параметри температурних циклів
- •Аналіз плр-ампліфікованої днк
- •Real-time pcr (прл у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях.
- •Словник використаних термінів
- •Верхній агар
- •Нижній агар
- •Цитратний буфер, 0,1м, рН 3,0 –6,2
- •Ацетатний буфер,0,1м , рН 3.6-5,6 Розчин а
- •0,1М оцтова кислота
- •С) Солі та інші речовини, г/л
Методи виявлення та ідентифікації вірусів у клітинних культурах
Існують наступні основні методи індикації (виявлення) вірусів у культурі клітин:
-
за цитопатичним ефектом чи цитопатичною дією (ЦПЕ,ЦПД);
-
за виявленням внутрішньоклітинних включень;
-
електронною мікроскопією;
-
в реакціях імуноферментного та радіоімунного аналізу (ІФА, РІА);
-
в реакції гемадсорбції (РГАд) (рис.15 (кольорова вклейка));
-
в реакції імунофлюоресценції;
-
за виявленням інтерференції вірусів;
-
за пригніченням метаболізму клітин (кольорова проба);
-
за утворенням бляшок.
Цитопатична дія
Найбільш широко та часто про розмноження вірусу в культурі клітин роблять висновок за цитопатичним ефектом чи цитопатичною дією (ЦПЕ, ЦПД). ЦПД – це явище, що призводить до руйнування структури клітин під впливом вірусів.
Причини ЦПД:
-
порушення нормальної життєдіяльності клітин в результаті механічного пошкодження клітинних структур вірусними компонентами (дефекти цитоплазматичної мембрани, які виникають в результаті проникнення чи виходу вірусів із клітини);
-
руйнування лізосом і вихід їх ферментів у цитоплазму (автоліз клітин);
-
виснаження білкових та енергетичних ресурсів клітин за рахунок “переключення” клітинних ферментів та білок-синтезуючого апарату на синтез вірусспецифічних компонентів;
-
порушення клітинного моношару.
За терміном виникнення ЦПД поділяють на ранню та пізню. Рання ЦПД виявляється в перші години після інфікування (від 3 годин після інфікування клітинних культур вірусом), спричиняється дією структурних елементів вірусів/ У цей період ще не відбулося проникнення вірусу в клітину. Даний тип ЦПД морфологічно проявляється в порушенні клітинного моношару, заокругленні клітин, відокремленні їх від скла(рис.2.23.а.).
Пізня ЦПД виявляється, коли вірус (чи його геном) потрапляє в клітину і, як правило, на кінцевих стадіях репродукції вірусів у клітині. Пізня ЦПД проявляється в утворенні полікаріоцитів і включень (рис.2.23.b.).
. |
|
|
|
Рис.2.23. Рання та пізня ЦПД при герпесвірусній інфекції
Для характеристики деструктивних змін одношарових культур клітин, що заражені різними вірусами, найчастіше використовується робоча класифікація ЦПД (О.Г. Анджапарідзе, 1962):
1 група. Рівномірно розподілена дрібнозерниста деструкція клітин – виникає при ураженні клітин вірусами поліомієліту, Коксакі, ЕСНО (рис.2.24.a, рис.11.a. (кольорова вклейка)), ЕСМО, віспи, грипу та ін.
2 група. Вогнищева дрібнозерниста деструкція клітин з тяжами незмінених клітин між ними - виникає при ураженні клітин вірусами весняно-літнього енцефаліту, вірус хвороби Ауескі (псевдосказу), спумавірусами (рис.2.24.b) та ін.
3 група. Осередкові скупчення заокруглених клітин, що нагадують грона винограду - виникає при ураженні клітин аденавірусами (рис.12 (кольорова вклейка)).
4 група. Рівномірно-розподілена крупнозерниста деструкція клітин (клітини збільшені у розмірі, заокруглені) - виникає при ураженні клітин вірусом простого герпесу (рис.11.b. (кольорова вклейка)), мавп’ячим вірусом В та ін.
5 група. Утворення гігантських багатоядерних клітин – симпластів та синцитіїв - виникає при ураженні клітин вірусами кору, вісповакцини, герпесу та ін (рис.13 (кольорова вклейка)). При цьому типі ЦПД відбувається розчинення клітинних оболонок, внаслідок чого цитоплазма сусідніх клітин зливається, утворюючи єдине ціле, в якому (в основному по периферії) розташовані ядра клітин.
a b
Рис.2.24. Заокруглення клітин у випадку зараження культури клітин вірусом ECHO (a) та цитопатична дія спумовірусу на клітини (b)
Слід розрізняти термін симпласт та синцитій. Різниця між цими поняттями полягає в тому, що синцитії виникають у результаті часткового злиття цитоплазматичної мембрани клітин, на відміну від повного злиття мембрани при утворенні симпластів. Таким чином, синцитій – це група клітин, які з’єднані між собою протоплазматичними відростками, а симпласти мають загальну масу протоплазми, в якій міститься багато ядер.