Одношарові культури клітин

Принцип методу одношарових культур клітин полягає у вирощуванні клітин, отриманих, як правило, шляхом ферментативної дезінтеграції на скляній поверхні у вигляді моношару, і базується на явищі адгезії – здатності клітин прикріплюватися до скляної поверхні. До одношарових культур відносять первинні, або первинно-трипсинізовані, диплоїдні, гетероплоїдні та постійні (перещеплювані) культури клітин (рис.2.19.).

Первинна культура клітин (первинно-трипсинізованан культура) – культура, яка походить від клітин та органів, взятих безпосередньо з організму. Для отримання первинних культур клітин використовують різноманітні тканини та органи людини та тварин. Після відповідної обробки їх подрібнюють на фрагменти 1-2 мм та оброблюють протеолітичними ферментами (трипсин, версен), які руйнують міжклтинні зв’язки, внаслідок чого отримують завись окремих клітин, які легко підрахувати.

Культури називають первинними до початку пасування чи субкультивування.

Як правило, культури, отримані з ембріональних тканин, характеризуються кращим виживанням та більш активним ростом у порівнянні з культурами з відповідних дорослих тканин. Це відображає більш низький рівень спеціалізації та наявність стовбурових клітин в ембріонах. Отримання первинних культур клітин дорослих тканин (в основному з нирок) та їх розмноження є більш складним завданням, і тривалість життя таких культур, як правило, не велика (максимум 20 генерацій при культивуванні in vitro у порівнянні з 50 генераціями первинних клітин, отриманих з ембріональних тканин). Первинні культури клітин мають різну чутливість до вірусів (табл. 2.10.). Така чутливість визначається типом тканини, з якої була отримана первинна культура, та тропізмом вірусу.

Рис.2.19. Схематичне зображення «розгалуження» клітин, що культивуються, від соматичної тканини

Приклади первинних культур клітин – нирка ембріону людини (рис.2.20), нирка макаки-резус, нирка африканської зеленої мавпи, нирка ембріону свині, фібробласти курячих ембріонів та ін.

З часу отримання субкультури первинна культура отримує назву клітинна лінія. Клітинні лінії можуть мати обмежений час існування in vitro (наприклад, диплоїдні фібробласти людини та тварин), а можуть розмножуватися in vitro необмежено довго (постійні, безперервні або перещеплювані клітинні лінії).

Рис. 2.20. Первинна культура фібробластів людини

Штам клітин – це популяція однорідних клітин (за одним чи декількома маркерами), які зберігають специфічні властивості протягом обмеженого періоду культивування. Штам клітин може походити з первинної культури чи від лінії клітин шляхом селекції чи клонування клітин із специфічними властивостями.

Клоновими лініями, чи клонами, називають культури, вирощені з однієї ізольованої клітини.

Після висіву клітин на поживне середовище вони входять у фазу адаптації, або лаг-період, тривалістю 2-24 години, після якого починається період експоненційного росту (логарифмічна фаза) – кількість клітин збільшується у двічі через правильні проміжки часу (рис.2.21.). У кінці цього періоду клітини досягають правильного моношару і входять у період уповільненого росту чи спокою (стаціонарна фаза чи фаза плато). Якщо на даному етапі культивування не відбудеться перенесення клітин на свіже поживне середовище, то наступає фаза старіння та загибелі клітин. Розмножуючись, клітини розміщуються на поверхні скла і при повному його покритті в один шар контактують одна з одною і перестають ділитися (спостерігається явище контактного гальмування) (Рис 2.19). На склі формується шар товщиною в одну клітинну, тому такі культури клітин називають одношаровими чи моношаровими.

Рис. 2.21. Крива росту клітин у культурі:

1 – лаг - фаза;

2 – фаза експоненційного росту (логарифмічна фаза);

3 – стаціонарна фаза;

4 – фаза відмирання клітин.

Як правило, моношар формується через 3-5 діб. Швидкість його формування залежить від виду тканин, віку донора, якості поживного середовища, посівної концентрації клітин та інших факторів.

Поживне середовище замінюють по мірі його забруднення продуктами життєдіяльності клітин. Моношар зберігає свою життєздатність впродовж 7-21 діб (у залежності від виду клітин та поживного середовища).

Таблиця 2.10.