Радіоімунологічний аналіз (ріа)
В 1959 р. Р. Ялоу і С. Берсон розробили кількісний імунологічний метод виявлення інсуліну в плазмі людини з використанням інсуліну, міченого радіоактивним ізотопом йоду (151J). Використання радіоактивних ізотопів в поєднанні з імунохімічними методами досліджень дозволяє реалізувати виключну вибірковість останніх для мінімальних кількостей біополімерів. Особлива перевага радіоімунологічного аналізу – висока чутливість. З його допомогою вдається виявити нанограмові (10-9), а іноді і пікограмові (10-10) рівні антитіл та вірусів. В РІА поєднується специфічність, властива реакціям антиген-антитіло, з чутливістю, яку дає використання радіоактивної мітки.
Радіоімунологічний аналіз базується на законі дії мас, за яким речовина, що визначається, буде конкурувати зі своїм міченим аналогом (антигеном) за обмежену кількість зв’язуючих місць антитіла до досягнення хімічної рівноваги всіх компонентів реакційної суміші.
Принцип методу можна представити наступним чином:
де А1 – вільний мічений антиген; В – специфічне антитіло; А – немічений антиген в дослідному матеріалі; А1В – зв’язаний мічений антиген; АВ – зв’язаний немічений антиген.
Мічений антиген зв’язується зі специфічним антитілом з утворенням міченого комплексу антиген-антитіло. При проведенні РІА проявляється здатність неміченого антигену дослідного матеріалу конкурувати за активні центри антитіл, пригнічуючи зв’язування міченого антигену. Як результат конкурентного пригнічення відношення зв’язаного з антитілом антигену до вільного міченого антигену зменшується при збільшенні концентрації неміченого антигену. Іншими словами, метод базується на здатності антитіл зв’язуватися з міченим радіоактивним ізотопом антигеном та на конкурентному пригніченні цієї реакції неміченим антигеном. Потім, коли цей антиген відділяється від незв’язаного, вимірюється радіоактивність однієї або обох фракцій.
Мітять препарати антигенів як правило радіоактивним 125І. Відомі різні засоби йодування білків: хлораміновий метод, лактопероксидазний, активованим ефіром та інші.
Існує декілька варіантів РІА, з яких в вірусології для практичної мети найчастіше використовують адсорбційний в різних модифікаціях: конкурентний метод (в рідкій фазі) та твердофазні прямий і непрямий методи. Останнім часом РІА використовується все рідше, оскільки пов’язаний з застосуванням радіоактивних ізотопів.
Імунофлуоресцентний аналіз (іф)
Імунофлуоресцентний аналіз, або метод флуоресціюючих антитіл, з’явився на початку 40-х років ХХ ст., коли А. Кунс з співробітниками використали здатність до флюоресценції одного з флюорохромів, кон’югували з ним антитіла і показали наявність збудника інфекції в тканинах. З того часу метод отримав значний розвиток і почав використовуватись в різних областях науки.
Особливість цього методу заключається в тому, що імунний комплекс стає видимим в люмінесцентному мікроскопі у випадку, якщо імуноглобулін кон’югується флюорохромом (флюоресцеіном, родаміном та ін.). В результаті ковалентного зв’язку антитіла з флюоресциюючим барвником утворюється нова сполука – флюоресциюючі антитіла. При цьому антитіла зберігають свою основну властивість – специфічність, а флюорохром – здатність до випромінювання світла.
Перевага імунофлуоресцентного аналізу в порівнянні з іншими методами полягає в дослідженні внутрішньоклітинної локалізації антигену (Рис. 20 (кольорова вклейка)).
Розроблені декілька варіантів реакції імунофлюоресценції: прямий, непрямий, сендвіч-метод, модифікація непрямого методу з використанням комплементу та інші (Рис.6.5).
Рис. 6.5. Порівняння різних модифікацій імунофлюоресцентного аналізу.