- •Розділ 1. Організація вірусологічних лабораторій.
- •Обладнання вірусологічних лабораторій
- •Правила роботи в учбових вірусологічних лабораторіях
- •Практична частина
- •Контрольні питання та контрольні завдання
- •Література
- •Тема 1: Використання лабораторних тварин у вірусологічних дослідженнях
- •Природні інфекційні хвороби деяких лабораторних тварин, збудники яких є патогенними для людини
- •Індикаторні тварини
- •Гнотобіотичні тварини
- •Показники мікроклімату в приміщеннях для лабораторних тварин
- •Густота посадки в клітках лабораторних тварин та птахів
- •Причини канібалізму та заходи його профілактики
- •Основні показники нормальної життєдіяльності різних видів тварин
- •Зв’язок тропізму вірусу зі способом ураження чутливого організму та видом патологічного матеріалу
- •Допустимі дози досліджуваного матеріалу, що вводиться лабораторним тваринам, мл
- •Методи зараження через травний тракт
- •Перкутанне (нашкірне) зараження
- •Кутанне (шкірне) зараження
- •Субкутанне (підшкірне) зараження
- •Інтракутанне (внутрішньошкірне) зараження
- •Інтравенозне (внутрішньовенне) та інтракардіальне (внутрішньосерцеве) зараження
- •Інтрамускулярне (внутрішньом’язеве) зараження
- •Інтраперітонеальне (внутрішньочеревинне) зараження
- •Субокципітальне (каркове) зараження
- •Інтрацеребральне (внутрішньомозкове) зараження
- •Зараження в периферичний нерв
- •Інтратестикулярне (внутрішньосім’яникове) зараження
- •Інтраокулярне зараження
- •Корнеальне зараження
- •Інтракорнеальне зараження
- •Кон’юнктивальне зараження
- •Забір крові
- •Антикоагулянти
- •Лабораторне заняття
- •Тема 2. Курячі ембріони та їх використання у вірусології
- •Теоретична частина
- •Практична частина
- •Будова курячого ембріону
- •Практична частина Лабораторне заняття
- •Тема 3. Клітинні культури у вірусології
- •Теоретична частина
- •Класифікація тваринних культур клітин
- •Одношарові культури клітин
- •Чутливість первинних культур клітин до вірусів людини
- •Характеристика деяких із відомих клітинних ліній
- •Переваги та недоліки використання постійних культур клітин
- •Чутливість постійних клітинних культур до вірусів
- •Суспензійні культури клітин
- •Зберігання культур клітин
- •Умови культивування клітин in vitro
- •Поживні середовища
- •Середовище 199 (Морган, Мортон, Паркер; 1950 р.)
- •Контамінація культур клітин
- •Взаємодія вірусів із клітинами
- •Методи виявлення та ідентифікації вірусів у клітинних культурах
- •Цитопатична дія
- •Внутрішньоклітинні включення
- •Титрування вірусів у одношарових культурах клітин
- •Практична частина Лабораторне заняття
- •Хід роботи
- •Контрольні завдання
- •Контрольні запитання
- •Література
- •Розділ 3. Віруси бактерій
- •Теоретична частина Загальна характеристика вірусів бактерій
- •Практична частина Методи титрування бактеріофагів
- •Титрування фагу за методом Аппельмана (рідке середовище)
- •Хід роботи:
- •Практична робота: Виділення фагів із лізогенних культур
- •Розділ 4. Дослідження вірусів рослин
- •Теоретична частина
- •Практична частина
- •Тема. Способи передачі вірусів рослин. Рослини-індикатори.
- •Практична частина Лабораторне заняття
- •Тема. 2. Виділення, очистка та концентрування вірусів рослин
- •Практична частина
- •Теоретична частина
- •Розділ 5. Використання електронної мікроскопії у вірусологічних дослідженнях.
- •Практична частина Хід роботи
- •Розділ. 6. Методи діагностики вірусних інфекцій та ідентифікації вірусів
- •Тема 1. Серологічні методи досліджень
- •Теоретична частина Реакція гемаглютинації
- •Імунологічні методи дослідження
- •Імунодифузійні тести.
- •Радіоімунологічний аналіз (ріа)
- •Імунофлуоресцентний аналіз (іф)
- •Імуноферментний аналіз
- •Практична частина Практична робота №1
- •Хід роботи
- •Практична робота №2
- •Хід роботи
- •Список літератури
- •Тема 2. Застосування полімеразної ланцюгової реакції у вірусологчних дослідженнях
- •Обладнання для плр
- •Компоненти реакції.
- •Параметри температурних циклів
- •Аналіз плр-ампліфікованої днк
- •Real-time pcr (прл у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях.
- •Словник використаних термінів
- •Верхній агар
- •Нижній агар
- •Цитратний буфер, 0,1м, рН 3,0 –6,2
- •Ацетатний буфер,0,1м , рН 3.6-5,6 Розчин а
- •0,1М оцтова кислота
- •С) Солі та інші речовини, г/л
Контамінація культур клітин
Вірусологічні дослідження, які проводяться з використанням клітинних культур, потребують постійного контролю присутності сторонніх мікроорганізмів (контамінантів) – вірусів, бактерій, грибів, мікоплазм та клітин інших клітинних культур. На відміну від організму людини, імунна система якого володіє багатьма різноманітними механізмами захисту від інфекцій, клітини в культурі in vitro захищені лише обережністю роботи дослідника.
Найпоширенішими контамінантами клітинних культур є мікоплазми. І хоча культури первинних клітин не забруднені мікоплазмами, багато ліній і штамів постійних клітин мають таке забруднення. Джерелом мікоплазм можуть бути сироватка тварин, яка частіше за все буває забруднена Acholeplasma laidlawii та Microplasma arginini, а також власне дослідники, оскільки M. hominis, M. рharingis та M. salivarium легко виділяються з порожнини рота та глотки людини. Забруднення культур клітин мікоплазмами не є таким очевидним, як бактеріями. У зв’язку з цим їх своєчасне виявлення – важлива умова підтримання високої якості культури клітин. Крім того, невиявлені та не видалені мікоплазмені інфекції, як і інфекції, викликані іншими контамінантами, можуть змінювати метаболізм клітин, викликати хромосомні порушення, впливати на сприятливість клітин до вірусів, що досліджуються. Особливо це стосується латентних інфекцій.
Попередити розмноження та знищити бактерії, мікоплазми та гриби вдається за допомогою протимікробних препаратів (антибіотики та ін.), які додаються в ростові середовища безпосередньо перед їх використанням. Однак при тривалому культивуванні клітинних культур застосування антибіотиків не бажано. Тому при роботі з клітинами необхідно дотримуватися стерильних умов роботи для запобігання забруднення мікроорганізмами, та проводити адекватні тести для оцінки їх ефективності.
Взаємодія вірусів із клітинами
При взаємодії вірусу з клітиною можна виділити такі основні стадії:
-
Початковий період
-
Адсорбція віріону на поверхні клітини (зворотна та незворотна адсорбція) – прикріплення вірусних часток до клітинної поверхні (рис.10. (кольорова вклейка)) (не характерно для вірусів рослин).
-
Проникнення вірусу в клітину – за рахунок рецепторного ендоцитозу чи злиття вірусної та клітинної мембран.
-
Звільнення вірусного геному (депротеїнізація вірусу, „роздягання” вірусної нуклеїнової кислоти).
-
-
Середній період ( „темнова”, екліпс - фаза)
-
Синтез ранніх (неструктурних) вірусних білків.
-
Синтез компонентів майбутніх вірусних часток – реплікація вірусних нуклеїнових кислот та синтез пізніх (структурних) вірусних білків.
-
-
Заключний період
-
Формування віріонів – збірка вірусних компонентів.
-
Вихід віріонів із клітини.
-
Реакція клітин на вірусну інфекцію досить різноманітна. Запропоновано багато способів класифікації реакції клітин на зараження вірусами. Найбільш прийнятою є класифікація вірусних інфекцій на клітинному рівні, що запропонована В.М. Ждановим та А.Г. Букринською (1986). Вірусні інфекції підрозділяються на автономні та інтеграційні.
Автономний – тип вірусної інфекції, при якому вірусний геном реплікується незалежно від клітинного.
Інтеграційний - тип вірусної інфекції, при якому вірусний геном частково або повністю інтегрується з клітинним геномом та реплікується разом з ним.
Продуктивна вірусна інфекція завершується утворенням інфекційного потомства, на відміну від абортивної, для якої не характерне утворення інфекційних часток, або вони утворюються в значно меншій кількості, ніж при продуктивній вірусній інфекції.
Гостра вірусна інфекція – це така форма інфекції, за якої після утворення вірусного потомства клітина або гине, або видужує і не містить вірусних компонентів. При хронічній вірусній інфекції клітини продовжують продукувати вірусні частки або їх компоненти протягом тривалого часу і передають цю здатність спадково. Гостра інфекція, яка завершується загибеллю клітини (лізисом), носить назву цитолітичної, а гостра вірусна інфекція, яка безпосередньо не призводить до лізису клітини, і при якій клітина ще може функціонувати впродовж деякого часу, продукуючи вірусні частки, називається нецитолітичною.
При взаємодії вірусів із клітинами в культурі спостерігаються різні патологічні зміни, які зумовлені рядом факторів:
-
особливістю реплікації віріонів;
-
чутливістю клітин до вірусів;
-
умовами культивування клітин (склад поживного середовища, рН середовища, температурою культивування).
Патологічні зміни уражених вірусами клітин зумовлені специфічними та неспецифічними процесами. До неспецифічних процесів відносять процеси, обумовлені змінами деяких ланок обміну речовин, зміною проникності цитоплазматичної мембрани, а саме:
-
дезінтегративне набрякання ядер клітин – феномен збільшення розмірів ядра клітини в результаті стимуляції обміну речовин при вірусній інфекції;
-
зміна метаболізму та мітотичного поділу клітини;
-
цитотоксичну дію вірусів – вплив вірусів на клітину ще до стимуляції обміну речовин.
Названі зміни відносять до неспецифічної взаємодії вірусів із клітинами, тому що вони не залежать від дози вірусу, розмірів віріонів, типу клітин, характеру утворення включень, тривалості вірусної інфекції.
До специфічних процесів взаємодії вірусу з клітиною відносять:
-
різноманітні зміни, що проявляються в пригніченні синтетичних процесів, порушенні функціональної активності, пошкодженні структур клітини та її загибелі (ЦПД, утворення включень);
-
цитопроліферативний ефект, який, як правило, призводить до трансформації клітин;
-
резистентність клітин до вірусів;
-
вірусопатичну дію;
-
синтез неповноцінних віріонів та вірусних специфічних антигенів (при абортивній інфекції);
-
індуктивний вплив вірусу (синтез інтерферонів).