1. Реакция с хлорным железом.

В молекуле адреналина пирокатехиновое ядро образует с ионами железа соединения типа фенолята.

Ход определения. К 3 каплям раствора адреналина прибавляют каплю 1% раствора хлорного железа. Появляется зеленая окраска. После добавления 1 капли 10% раствора NаОН окрашивание становится вишнево-красным.

2. Реакция с йодатом калия.

Принцип реакции заключается в том, что адреналин легко окисляется с образованием окрашенного в красный цвет адренохрома. Ход определения. В пробирку вносят 3 капли раствора адреналина (1:1000), добавляют по 2 капли 10% раствора КОJO₃ и 10% раствора уксусной кислоты (СН₃СООН) и слегка нагревают. Жидкость окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Работа 3. Качественная реакция на тироксин (открытие йода).

При разрушении тироксина щелочью образуется йодистый калий, из которого йод легко вытесняется йодноватокислым калием. Выделившийся свободный йод с крахмалом дает синее окрашивание.

5 KJ + КJO₃ + 3 Н₂S0₄ = 3 J₂+3 К₂SО₄ + 3 Н₂О

J₂ + крахмал → синее окрашивание

Ход определения.

1. Щелочной гидролиз тиреоидина. 5 таблеток тиреоидина тщательно растирают в ступке, пересыпают в колбочку для гидролиза, добавляют 5 мл 10% раствора КОН и 5 мл воды. Содержимое колбы кипятить в течение 10-15 мин.

2. Открытие йода в гидролизате. К 1 мл охлажденного гидролизата добавляют по каплям 10% раствор Н₂SO₄ до кислой реакции на лакмус, после чего прибавляют 3-4 капли 1% крахмала и 5-10 капель 2%-ного раствора КJO₃ . Выделившийся йод дает синее окрашивание с крахмалом.

Работа 4. Количественное определение адреналина

в биологических жидкостях.

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении интенсивности синего окрашивания, которое образуется при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина.

Ход определения. В 2 центрифужные пробирки (опыт и контроль) вносят по 1 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. В опытную пробирку приливают 0,1 мл сыворотки, плазмы крови или 0,5 слюны. В контрольную - такой же объем дистиллированной воды. Смесь взбалтывают и центрифугируют при 2000-3000 об/мин, в течение 5-6 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают в чистую пробирку, добавляют 4 мл 10% раствора углекислого натрия и 0,5 мл реактива Фоля. Развивается синее окрашивание, интенсивность которого измеряют с красным светофильтром в кювете на 10 мм против контроля.

Количество адреналина в пробе определяют по калибровочной кривой с 10, 15 и 20 мкг адреналина в 0,1 (или 0,5 для слюны) мл воды и выражают в мкг на литр биологической жидкости.

У здорового человека в плазме (сыворотке) крови и слюне содержится соответственно 100-230 и 0-30 мкг/л адреналина.

В период эмоционального (или физического) напряжения, у больных феохромоцитомой (опухоль мозгового слоя надпочечников) содержание гормона возрастает в 2-4 и 10-20 раз соответственно.

Работа 5. Пробы коллоидоустойчивость белков плазмы крови

Данная группа проб основана на исследовании изменений коллоидной устойчивости белков сыворотки крови при патологических состояниях, сопровождающихся диспротеинемией. Лабильность сывороточных белков в первую очередь определяется соотношением крупно- и мелкодисперсных фракций (альбумины/глобулины) и снижением коллоидоустойчивости при действии различных денатурирующих агентов может быть связано с относительным увеличением глобулинов при уменьшении альбуминов. Большое

значение имеет и относительное увеличение γ-глобулинов в глобулиновой фракции.

Осадочные пробы широко распространены в клинической практике.

А. Тимоловая проба. Основана на образовании плохо растворимого глобулино-тимололипидного комплекса при взаимодействии сыворотки крови с тимоло-вероналовым буфером.

Ход работы. К 6 мл тимоло-вероналового буфера рН 7,6 прибавить 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови и через 30 мин отколориметрировать при красном светофильтре в кюветах толщиной 10 мл против тимоло-вероналового буфера. Расчет произвести по калибровочному графику.

В норме интенсивность помутнения колеблется в пределах от 0 до 4 условных единиц.

Б. Проба Вельтмана. В основе ее лежит нарушение коллоидоустойчивости белков сыворотки крови в присутствии раствора хлористого кальция при нагревании.

Ход работы. К 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови прилить 4,9 мл воды, перемешать и нагреть надпламенем спиртовки до однократного закипания пробы. Охладить смесь и посмотреть ее содержимое на свет. Если в пробирке нет единичных хлопьев коагулированного белка, добавить еще 0,1 мл 0,5% раствора хлористого кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторять до тех пор, пока не выпадут хлопья.

В норме коагуляции наступает при добавлении 0,4-0,5 мл раствора хлористого кальция.

Работа 6. Количественное определение альдолазы в сыворотке крови(метод Брунса в модификации Е.Н. Валуйской и В.И. Товарницкого)

Активность веществ альдолазы в сыворотке крови составляет 3-13 единиц и выше. Активность альдолазы увеличивается при инфекционном гепатите, токсических поражениях печени и некоторых других заболеваниях.

Принцип метода. Альдолаза расщепляет фруктозо-1,6-дифосфат, продукты расщепления которого образуют с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде соединения, окрашенное в малиной цвет. Фруктозо-1,6-дифосфат инкубируется в буферном растворе с исследуемой пробой и гидразинсульфатом для связывания образующихся фосфотриоз. Белки осаждаются трихлоруксусной кислотой и в фильтрате фотометрически определяется окрашенное производное фосфотриоз. Интенсивность окраски пропорциональна активности альдолазы.

Ход работы. В центрифужную пробирку поместить 0,5 мл исследуемой сыворотки крови, 0,5 мл 0,5 % раствора NaHCO₃, 0,12 мл гидразинсульфата, 0,12 мл 0,002 М раствора монойодуксусной кислоты, 0,12 мл дистилли

рованной воды и 0,12 мл раствора фруктозо-1,6-дисфосфата. Смесь в пробирке перемешеть и поместить в термостат на 1 час при 38°С. После этого в пробирку добавить 1,5 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и содержимое пробирки отцентрифугировать 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость 0,5 мл перенести в чистую пробирку ,добавить в нее 0,5 мл 3 % раствора NаОН и оставить на 10 мин при комнатной температуре. После этого добавить 0,5 мл 0,1 % раствора 2,4-динитрофенилгидразина и поставить в термостат при 38°С. По истичении мин к содержимому пробирки добавить 3,5 мл 3% раствора NаОН и колориметрировать на ФЭКе в кювете толщиной 5 мм с зеленым светофильтром против воды.

Активность альдолазы сыворотки крови выражают в условных единицах экстинкции, умноженных на 100.

Работа 7. Определение активности альдолазы фруктозо-1-монофосфата

Альдолаза фруктозо-1-монофосфата находится лишь в гепатоцитах, и обнаружение активности этого фермента в сыворотке крови является специфическим для поражений паренхимы печени.

Принцип метода основан на связывании фосфотриоз, образующихся после расщепления ферментов фруктозо-1-фосфата, гидразином, с последующим определением триоз, освобождающихся при щелочном гидролизе продуктов динитрофенилгидразиновой реакции.

Ход работы. В пробирку внести 1 мл сыворотки крови и 0,5 мл субстратного раствора (100 мл бариевой соли фруктозо-1-фосфата растворить в 180 мл дистиллированной воды, прибавить 82мл гидразин-гидрохлорида и довести рН до 7,4, добавляя 0,75н. NаОН, прилить веронал-мединаловой буфер рН 7,4 до конечного объема 400 мл).

В контрольную пробирку внести 1 мл сыворотки крови. Инкубировать в термостате контрольную и опытную пробу 30 мин при 37°С. После инкубации в контрольную пробирку добавить 0,5 мл субстратного раствора. Остальные реактивы приливать в обе пробирки одновременно. Для дефосфорилирования образовавшейся фосфотриозы прибавить по 1 мл 0,75 н NаОН и оставить при комнатной температуре на 30 мин. Добавить по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина 0,1 % раствора в 2 н НСI (500 мл 2,4-ДНФГ растворяют в 80 мл концентрированной НСI при слабом нагревании и доводят до 500 мл водой) и оставить на 30 мин. Затем добавляют по 3 мл 0,75Н NаОН и через 5 минут опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре против контроля.

Количество образовавшихся триоз определяют по стандартной кривой, построенной по диоксиацетону. Активность фермента рассчитывают по форму

ле: А=а/Т, где А – активность фермента (мкмоль) в 1 мл сыворотки за 1 мин; а – количество образовавшихся триоз, рассчитанное по стандартной калибровочной кривой; Т – время инкубации (мин).

Ответы на тесты контроля исходного уровня знании

Вид 1. 1.1-А ; 1.2-Б. 1.3-3

Вид 2. 2.1: 1-А, В, Д; 2-Б.Г; 2.2: 1-Б; 2-А; 3-В.; 2.3: 1-Б; 2-В; 3-Г; 4-Д; 5А.

Вид 3. 3.1-Е(1,2,3,4), 3.2-А(1,2,3); . 5-В,Г;

В. Вид 4: 1.- А (верно, верно, верно). 2-А (верно, верно, верно).