Выполнение работы

Приборы: 1. Коллектор хроматографических фракций с дозатором объема фракции по времени или по числу капель. 2. Перистальтический насос для перекачки (с заданной скоростью) выходящего из колонки элюента к коллектору. 3. Штатив для колонки. 4. Спектрофотометр. 5. Кондуктометр.

Посуда: 1. Стеклянная хроматографическая колонка, длиной 20-25 см, диаметром 1,5-2 см. 2. Резиновая пробка с ниппелем и зажимом.3. Стеклянный стакан на 200 см³.4. Стеклянная пипетка на 10 см³. 5. Промывалка для дистиллированной воды. 6. Пробирки к коллектору для сбора фракций – 20 шт.

Реактивы: 1. Адсорбент – набухший в воде полисахаридный гель, в объеме 100 см³. 2. 1% раствор AgNO₃ в объеме ~ 5 см³. 3. Исследуемый образец водный раствор смеси полисахарида (голубого декстрана) и нитрата кобальта в объеме ~ 5 см³. 4. Фильтровальная бумага.

Гельхроматографическое разделение исследуемой смеси.

Вымытую стеклянную колонку плотно закрывают с нижнего конца резиновой пробкой с ниппелем в ней и устанавливают в штативе.

Во избежание просачивания геля пробирку изнутри накрывают кружочком фильтровальной бумаги. Вначале заполняют колонку на 1/3 высоты дистиллированной водой, а затем постепенно вливают из стакана набухший в воде гель адсорбента на 3 см. ниже верхнего отверстия и закрывают ниппель зажимом.

Подготовленный для разделения раствор смеси осторожно наносят пипеткой на обнажившийся верхний слой адсорбента и присоединяют к нижнему отверстию ниппеля полиэтиленовый шланг, идущий к перистальтическому насосу и далее к коллектору фракций.

Дождавшись полного впитывания нанесенного на адсорбент раствора через верхнее отверстие осторожно наносят пипеткой 2-3 см³ дистиллированной воды и включают насос на нужный режим элюирования. Затем верхнее отверстие колонки соединяют резиновым шлангом с резервуаром, наполненным дистиллированной водой и далее весь процесс идет уже автоматически.

Перемещение голубого кольца декстрана вниз по колонке хорошо заметно. Весь процесс разделения смеси полисахарид – нитрат кобальта при заданной скорости элюирования занимает 40-50 мин, за которые в коллектор собирается 15 фракций, т.е. 1 фракция за 3 минуты.

Каждую из фракций анализируют спектрофотометрически на присутствие полисахарида, и кондуктометрически на присутствие нитрата кобальта.

Спектрометрический анализ полисахарида на спектрофотометре

Включают прибор и выдерживают его 3 минуты для выравнивания силы тока до 300 микроампер, затем включают излучающую водородную лампу и дожидаются загорания (со щелчком). Затем открывают крышку кюветодержателя (объектив фотоэлемента закрыт), поворачивают рукоятку видов работ в положение “on” – “включено” (положение “off” – “выключено”) и выдерживают 10 минут. Рукояткой регулировки длины волны “wavelength” – устанавливают соответствующий образцу узкий интервал со значением “λ” = 280 нм. Выдвижными ручками регулируют установку системы из двух фотоэлементов (одного для УФ – диапазона, другого для видимого ИК диапазона). Рукояткой “Durk-current” стабилизируют ультрафиолетовое излучение выбранного диапазона (“темновой” ток), фиксируя стрелку нуль прибора в среднем положении. Затем измеряют оптическую плотность “D” раствора. Кювету с растворителем помещают в кюветодержатель, закрывают его крышку (объектив фотоэлемента открыт для измерения). Рукоятку видов работ переключают из положения “on” в положение “ x I”, а рукоятку отсчета “reading” в положение ноль. Рукояткой “щель” – “slit” (узкая полоса диапазона) вначале грубо переводят стрелку нуль – прибора в положение 0, а рукояткой чувствительности производят точную доводку стрелки шкалы до 0, снимая после этого со шкалы отсчета “reading” значение оптической плотности “D” образца. Затем последовательно анализируют фракции элюента из колонки и строят график изменения оптической плотности “D” (полисахарид) в ходе хроматографирования, откладывая на оси абсцисс номера фракции, а на оси ординат – оптическую плотность “D” (рис. 18). Из графика следует, что вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение с длиной волны “λ” = 280 нм, содержится во фракциях с № 6 по № 10.

Кондуктометрический анализ нитрата кобальта на кондуктометре ОК – 102/1.

Из-за чувствительности прибора к присутствию сильных электролитов электрод, состоящий из двух проводников – электродов, должен быть очищен от следов электролитов промыванием в дистиллированной воде. Затем измеряют поочередно электропроводность хроматографических фракций с разным содержанием нитрата кобальта и строят график (рис. 18).

Рис. 18. Совмещенные графики оптической плотности и электропроводности (пунктиром) серии хроматографических фракций

Из графика следует, что фракции № 1-4 содержат чистый растворитель, фракции № 5-8 содержат лишь полисахарид, фракции № 10-12 содержат лишь Co(NO₃)₂, фракция № 9 содержит смесь обеих веществ (неполнота разделения).