Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопическое исследование мокроты больного туберкулезом (демонстрационный препарат, окраска по Цилю-Нильсену). В поле зрения микроскопа видны одиночные или в виде скоплений микобактерии, окрашенные в рубиново-красный цвет на голубом фоне препарата.

2. Изучение культуральных свойств возбудителя туберкулеза на среде Левенштейна-Йенсена.

3. Определение лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза к химиотерапевтическим средствам на среде Левенштейна-Йенсена.

4. Ознакомление с препаратами, применяемыми для диагностики, лечения и профилактики туберкулеза:

• туберкулин - фильтрат бульонной культуры микобактерий применяемый для постановки внутрикожной аллергической пробы Манту;

• вакцина БЦЖ (BCG – Bacterium Calmett – Geren); живая вакцина из авирулентного штамма M.bovis, разработанная французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется внутрикожно для активной специфической профилактики туберкулеза.

• препараты для лечения туберкулеза (стрептомицин, ПАСК, тубазид, фтивазид, метазид, этионамид, этамбутол, пиразинамид, рифампицин, циклосерин, канамицин, фторхинолоны и т.д.)

Микробиологическая диагностика проказы

Материалом для исследования являются соскоб со слизистой оболочки носа, кожные лепрозные узлы, пунктат лимфатичес­ких узлов, мокрота и др.

Микроскопический метод является основным в лабораторной диагностике проказы, так как доступных методов культивирования возбудителя проказы не разработано. Единственным методом культивирования возбудителя проказы является заражение экзотических животных – броненосцев. В мазках из патологического материала, взятого от больного проказой, палочка проказы (Mycobacterium leprae) при окраске по методу Циля-Нильсена окрашивается в рубиново-красный цвет и располагается в виде пачек сигар.

При проказе можно поставить кожную аллергическую пробу с лепромином (реакция Мицуды), однако диагностического значения эта реакция не имеет и применяется для характеристики клинического течения болезни.

Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции

Возбудителями менингококковой инфекции являются менингококки (Neisseria meningitidis). Методы лабораторной диагностики менингококковой инфекции представлены в схеме 16. Учитывая высокую нежизнеспособность менингококка во внешней среде, исследование на менингококк выполняют как можно быстрее.

Схема 16. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции

Материал для исследования:спинномозговая жидкость, кровь, мазки со слизистой оболочки верхних отделов носоглотки, содержимое элементов сыпи

Микроскопический метод. Мазок из спинномозговой жидкости в окраске по Граму с целью выявления гноя и грамотрицательных диплокок­ков внутри лейкоцитов в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой стороной друг к другу

Бактериологический метод.

1 день. Посев на сывороточный МПА с ристомицином. Культивирование при 37⁰ С в течение 48 часов.

3 день. Учет характера роста на сывороточном МПА (мелкие, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями колонии; в мазках полиморфные грамотрицательные дипло- и тетракокки. Типичные для менингококка колонии пере­севают на скошенный сывороточный МПА для выделения чистой культуры.

4-5 день. Идентификация выделенной чистой культуры менингококка и ее дифференциация от сап­рофитных нейссерий на основании комплекса биологических свойств (рост на МПА, потребность в СО₂, пигментообразование, ферментация углеводов, нитратредуктаза, антигенная структура - ОРА с менингококковыми сыворотками сероваров А, В, С). Окончательный ответ.

Серологический метод РНГА с парными сыворотками с целью обнаружения антител к менингококку (ретроспективная диагностика).

Генодиагностика - обнаружение специфических фрагментов ДНК менингококка с помощью ПЦР

Экспресс-методы - РИФ, непрямая латекс-агглютина­ция и РНГА с антительными диагностикумами с целью выявления антигенов менингококков в материале от больного

Микроскопический метод. Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Грама и микроскопируют. При наличии гноя и обнаружении внутри лейкоцитов грамотрицательных диплокок­ков в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой

стороной друг к другу, позволяет сделать положительное заключение о наличии у пациента менингококковой инфекции (рис. 22).

а б

Рис. 22. Менингококк (Neisseria meningitides) в спинно-мозговой жидкости больного эпидемическим цереброспинальным менингитом (а) и в чистой культуре (б). Окраска по Граму. х630

Микроскопическое исследование мазков из носоглотки бактерионосителей дает возможность выявить наряду с менингококком стафилококки, стрептококки и непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.), дифференциро­вать которые по морфологическим и тинкториальным свойствам практически невозможно.

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с сывороточным МПА, содержащим антибиотики (ристомицин, ванкомицин, колистин и ниста-

тин) для подавления роста сопутствующей микрофлоры (преимущественно кокков). Асцитическая жидкость в качестве добавки к питательным средам в настоящее время не

применяется, так как в результате лечения больных в ней накапливаются вещества, ингибирующие рост микроорганизмов (в том числе менингококка). Ме­нингококк на сывороточном МПА вырастает при температуре 37⁰ С в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (используют СО₂ инкубатор, газогенераторные пакеты или эксикатор с зажженной свечой) через 48 часов, колонии величиной с булавочную головку, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями. В мазках из чистой культуры менингококка (рис.21) микрокартина иная (полиморфные дипло- и тетракокки), чем в мазках из спинно-мозговой жидкости.

Типичные для менингококка колонии пере­севают в пробирку со скошенным сывороточным МПА для выделения чистой культуры. Идентификацию чистой культуры менингококка, ее дифференциацию от сап­рофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят на основании изучения комплекса биологических свойств (табл. 18).

Таблица 18. Основные биологические свойства нейссерий

Свойства	Виды нейссерий
	N.meningitidis	N.subflava	N.flava	N.mucosa	N.sicca
Рост на МПА	-	+	+	+	+
Потребность в СО2	+	-	-	-
Желтый пигмент	-	+	+	±	±
Ферментация: глюкозы мальтозы сахарозы фруктозы лактозы	К+ К+ - - -	К+ К+ К± К± -	- - - - -	К+ К+ К+ К+ -	К+ К+ К+ К+ -
Образование полисахарида из сахарозы	-	±	+	+	+
Нитратредуктаза	-	-	-	+	-
РА с менингококковыми сыворотками сероваров А., В, С	+	-	-	-	-

Обозначения: (+) – наличие признака, (-) – отсутствие признака, (±) – непостоянный признак, К – образование кислоты

Специфичес­кий полисахаридный менингококковый антиген можно выявить в спинномозговой жидкости с помощью метода встречного иммуноэлектрофореза в геле. С этой целью в агаровом геле на стеклянных пластин­ках, размером 9x12 см, вырезают два параллельных ряда лунок диаметром 3 мм. В лунки одного ряда вносят исследуемый ликвор, в лунки другого - преципитирующие сыворотки против менингококков разных серогрупп. Пластинки помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 40-45 мин при комнатной температуре. Положительный результат характеризуется появлением 1-2 полосок преципитации между лунками со спинномозговой жидкостью и соответствующей антисывороткой.

Генодиагностика. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР, что дает основание в случае получения положительного результата поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Для ретроспективного подтверждения диа­гноза используют РНГА с парными сыворотками.

Экспресс-методы диагностики. Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала использу­ют ИФМ, а также непрямую латекс-агглютина­цию и РНГА с антительными диагностикумами.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопический метод. Изучение морфологии менинго­кокка в мазках из ликвора больного с подозрением на менингококковую инфекцию (демонстрация). Типично наличие грамотрицательных диплококков, располагающихся внутри лейко­цитов.

2. Бактериологический метод. Учет культуральных свойств менингококка на сывороточном МПА с ристомицином. Колонии ме­нингококков прозрачные с голубым оттенком, ровные, мелкие (с булавочную головку). Изучить биохимические свойства менингококка в соответствии с таблицей .

3. Учесть демонстрационную РНГА с парными сыворотками больного (7 и 14 дни болезни) с подозрением на менингококковую инфекцию.