Бактериологический метод.

1. день.Посев на кровяной МПА илиPLET-агар. Культивирование посевов при 37⁰С.

2 день Учет характера роста (шероховатые колонии в виде «головы медузы»). Микроскопическое исследование типичной колонии, ее пересев на скошенный МПА для выделения чистой культуры.

3 день. Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств; постановка проб на фаголизабельность и чувствительность к антибиотикам. Биопроба.

4 день. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам и фаголизабельности. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупа животного, павшего в результате биопробы

Микроскопический метод.

Микроскопия окрашенных по Граму и Романовскому-Гимзе мазков из материала от больного с целью обнаружения крупных грамположительных капсулообразующих ба­цилл в виде цепочек, дающих специфическое све­чение оболочки в РИФ

Серологический метод

Постановка РНГА, РА с целью определения антител в крови больного

Аллергодиагностика

Постановка внутрикожной аллергической пробы с тулярином. Учет через 24-48 часов.

Биопроба

Заражение материалом от больного белых мышей. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов павших животных

Выявление сибиреязвенного антигена

Постановка реакции термопреципитации Асколи с преципитирующей противосибириязвенной сывороткой

Генодиагностика. ПЦР

Микроскопический метод. Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Романовскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных ба­цилл в виде цепочек дает возмож­ность поставить предварительный диагноз сибирской язвы (рис.11 а). В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся жел­то-зеленым ободком (рис. 11 б.).

Бактериологический метод - посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилен-диаминотетраацетатом (ЭДТА) и ацетатом таллия. Контаминированный мате­риал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорга­низмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 37⁰ С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы меду­зы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» - рис. 12. В бульоне характерен при­донный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается про­зрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (рас­положение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выде­ления чистой культуры типичные колонии пересевают на ско­шенный МПА.

Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3% голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 37⁰ С в атмосфере 5-7% СО_2.

а б

Рис. 11. Возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis). а - окраска по Граму, б – РИФ. х630

Рис. 12. Колония Bacillus anthracis. х56

Идентификацию выделен­ной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к ан­тибиотикам.

Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья». На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-ча­совую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 37⁰ С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные ба­циллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками.

Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и сходных с ним бацилл отражены в табл. 7.

Наличие сибиреязвенного антигена в разложившемся трупе жи­вотного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакции термо­преципитации по Асколи. Исследуемый материал измельчают, за­ливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д.

Биопроба. Исследуемым материалом подкожно заражают двух белых мышей., которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаружива­ют типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл.

Таблица 7. Дифференциально-диагностические признаки сибиреязвенной и других бацилл

Признак	Вид микроорганизмов
	Bacillus anthracis	Bacillus cereus	Bacillus mycoides	Bacillus thuringiensis	Bacillus subtilis	Bacillus megaterium
Капсула	+	-	-	-	-	-
Подвижность	-	+	-	+	+	+
Гемолиз	-	+	-	+	-	+
Рост в анаэробных условиях	+	+	+	+	-	-
Лецитиназа	+	+	+	+	-	-
Аргининдегидролаза	-	V	V	+	-	-
Нитpaтpeдyктaзa	+	+	+	+	+	-
Патогенность для мышей	+	-	-	-	-	-
Ферментация до кислоты:
глицерина	-	V	+	+	+	+
маннита	-	-	-	-	+	+
салицина	-	V	+	+	+	+

Обозначения: «-« - отрицательная; «+» - положительная; «V» - вариабельная реакции.

Серологический метод выполняется в тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного использу­ют реакции латекс-агглютинации и РНГА с протективным сибиреязвенным антигеном.

Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сибиреязвенной бациллы - антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.