Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопия мазков из чистой культуры золотистого стафилококка – Staphylococcus aureus. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно, выглядят в виде гроздьев винограда

2. Учет характера роста золотистого стафилококка (демонстрация) на ЖСА (расщепление лецитина в виде радужного венчика вокруг колоний) и кровяном МПА (гемолиз).

3. Дифференциация основных видов стафилококка (таблица 2) – (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus по образованию плазмокоагулазы, лецитиназы, альфа-токсина, ферментации маннита и глюкозы в анаэробных условиях - демонстрация).

4. Учет теста на антибиотикорезистентность методом бумажных дисков (демонстрация).

5. Определение фаговара стафилококка (демонстрация).

6. Знакомство с препаратами, используемыми для диагностики, профилактики и лечения стафилококковых и стрептококковых инфекций.

- стафилококковая вакцина - взвесь клеток коагулазоположительных штаммов S.aureus, убитая нагреванием. Используется для лечения вяло текущих стафилококковых инфекций;

- антифагин стафилококковый - экстракт из культур патогенных стафи­лококков, инактивированных при 100⁰ С, профильтрованный через бакте­риальный фильтр. Применяется для лечения хронических пиодермий;

- иммуноглобулин человеческий противостафилококковый - гамма-глобу­линовая фракция сыворотки крови, содержащая стафилококковые антитокси­ческие антитела. Применяется с лечебной целью;

- стафилококковый бактериофаг (жидкий) - фильтрат фаголизата стафилококка. Применяют наружно, внутрикожно и внутримышечно для лечения;

- диагностические стафилококковые фаги - набор типоспецифических фагов для фаготипирования стафилококков;

- стафилококковый анатоксин (очищенный адсорбированный) – получают из нативного анатоксина (токсин, обезвреженный формалином) путем осаждения трихлоруксусной кислотой и этанолом, с последующей адсорбцией на гидроксиде алюминия. Применяется для актив­ной иммунизации с целью профилактики и лечения стафилококковых инфекций;

Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций.

Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций отражена в схеме 2. Выполняются следующие методы исследования.

Бактериоскопический метод – выявление в мазке из гноя патогенных кокков, располагающихся в виде небольших цепочек. Типичное расположение в виде цепочек характерно для чистых культур стрептококка (рис. 2 цветная вкладка).

а	б
Рис. 2. Стрептококк (Streptococcus pyogenes). а – мазок из исследуемого материала, б - мазок из чистой культуры. Окраска по Граму. Грамположительные кокки, расположенные в виде цепочек. х900

Схема 2. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций
Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.
Микроскопический метод. Выявление грамположительных кокков в виде цепочек в мазках из материала от больного. Бактериологический метод. 1. день. Посев материала на чашки кровяным МПА, пробирки или флаконы с сахарным МПБ. 2 день - учет характера роста колоний (на кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение). В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде цепочек. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. Пересев с сахарного МПБ на кровяной МПА	3 день - идентификация выделенной культуры стрептококка, дифференциация основных видов, определение чувствительности к антибиотикам. Выделение чистой культуры с кровяного МПА. 4 день. Заключение о виде стрептококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день. Заключение о виде стрептококка, выделенного из сахарного МПБ. Серологический метод Реакция нейтрализации (РН) для определения антистрептолизина-О (гемолизина) и антигиалуронидазы в сыворотке крови больных стрептококковыми инфекциями.

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на кровяной МПА в чашках Петри. После выращивания в термостате при 37⁰ С в течение суток учитывают характер роста колоний (колонии очень мелкие, величиной с булавочную головку, круглые, мутноватые, матовые). Слизистые колонии типичны для свежевыделенных штаммов, стрептококка, матовые – для вирулентных стрептококков с высоким содержанием М-протеина, блестящие – для невирулентных штаммов. На кровяном МПА стрептококки вызывают α–гемолиз (зеленоватая зона вокруг колоний) или β-гемолиз (полностью прозрачная зона гемолиза). Негемолитические стрептококки обычно непатогенны. Из типичных для стрептококка колоний готовят мазок в окраске по Граму и после микроскопии (Streptococcus pyogenes окрашивается по Граму положительно, располагается в виде цепочек) делают пересев в пробирки с сахарным МПБ и кровяным МПА. На 3 день учитывают характер роста (на сахарном МПБ рост стрептококка в виде придонно-пристеночного осадка, сама среда прозрачна), готовят мазок в окраске по Граму и проводят идентификацию выделенной культуры стрептококка по антигенным свойствам. Серогруппу стрептококков определяют в реакциях преципитации, латекс-агглютинации или коагглютинации с целью выявления группоспецифического полисахаридного антигена А, используя группоспецифические сыворотки (обычно групп A, B, C, F, G). Большинство патогенных для человека стрептококков являются β-гемолитическими и относятся к группе A. Серовар выделенной культуры стрептококка выявляют с помощью реакции агглютинации (выявление типового протеинового антигена М, по которому выделяют около 100 сероваров) с типоспецифическими стрептококковыми сыворотками.

Для идентификации β-гемолитических стрептококков применяют PYR-тест (на пирролидониламидопептидазу), CAMP-тест (на белок синергидного гемолиза), тест Фогес-Проскауэра (на образование ацетоина), чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД на диск), галотолерантность (рост в присутствии 6,5% хлорида натрия), гидролиз гиппурата натрия, ферментацию трегалозы, сорбита и т.д. α -гемолитические стрептококки идентифицируют, используя тесты на чувствительность к желчи, оптохину, на гидролиз эскулина и т.д. (табл. 3).

PYR -mecm. В МПБ, содержащий 0,01 % L-пирролидонил- β –нафтиламин, вносят петлю агаровой культу­ры стрептококка, инкубируют при 37⁰ С в течение 4 ч. По­ложительная реакция характеризуется появлением ярко-крас­ного окрашивания после внесения 1 капли специального реактива.

САМР-тест. S. agalactiae вырабатывают внеклеточный протеин синергидного гемолиза, усиливающий лизис эритроцитов β -лизином стафилокок­ка. Для его определения на чашку с кровяным МПА засевают перпендикулярными штрихами исследуемую культуру стрептококка и суточную бульонную культуру стандартного β -гемолитического штамма Staphylococcus aureus. В ка­честве положительного и отрицательного контролей засевают со­ответственно культуры S. agalactiae и S. pyogenes, инкубация 18 ч при 37 °С. При положительном САМР-тесте на месте пересечения стафилококка и S. agalactiae появляется зона усиления гемолиза в виде «крыла бабочки».

Таблица 3 . Дифференциальные признаки стрептококков

Свойства	Микроорганизмы
	S. pyogenes	S. agalactiae	Стрептококки групп C и G	S. bovis
Вид гемолиза	β	β, α	β	α ,
Гидролиз гиппурата натрия	-	+	-	-
CAMP-тест	-	+	-	-
PYR-тест	+	-	-	-
Желчно-эскулиновый тест	-	-	-	+
Рост в солевом МПБ	-	+	-	-
Чувствительность к бацитрацину	+	-	-	-
Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму	-	-	+	+

Обозначения: (+) - постоянный признак, (-) – отсутствие признака

Исследование крови. Для выделения гемокультуры посев обычно производят в сахарный бульон. При нали­чии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный при­донный осадок, а в мазках обнаруживаются длинные цепочки стреп­тококков. Для выделения чистой куль­туры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3-й день исследования) появляют­ся типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Даль­нейший ход исследования аналогичен описанному выше.

Генодиагностика. Разработан метод ДНК-ДНК-гибридизации для обнаружения специфических фрагментов ДНК стрептококка в исследуемом материале, что дает основание поставить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.

Серодиагностика (определение антител к гемолизину – стрептолизину-О) проводится при подозрении на ревматизм. Сущность реакции заключается в нейтрализации антителами сыворотки крови больного гемолитической активности стрептококкового стрептолизина-О. Титр антистрептолизина-О у здоровых людей – до 250 АЕStO. При ревматизме с первых дней болезни титр антистрептолизина-О составляет 500 АЕStO и выше.