2. Индикация вирусов в клетках культуры ткани:

• гемадсорбция - адсорбция на клетках эритроцитов, добавленных к культуре ткани, инфицированной вирусом парагриппа (демонстрация);

• подавление метаболизма клеток вирусом полиомиелита (цветная проба –демонстрация). Клетки культуры ткани в процессе их культивирования вырабатывают кислые продукты метаболизма, при этом цвет среды, в которую добавлен индикатор метиловый красный, изменя­ется с красного на желтый. Клетки, инфицированные вирусом, разрушаются и цвет среды не меняется, оставаясь красным;

• интерференция вирусов - отсутствие репродукции вируса в культуре ткани, инфицированной другим вирусом, не обладающим цитопатическим эффектом (демонстрация).

3. Выделение и индикация вирусов на ркэ.

• обнаружение вирусов на хорион-аллантоисной оболочке РКЭ, зараженного вирусом герпеса (микроскопия мазков-отпечатков, окрашенных по Романовскому-Гимза – демонстрация));

• выявление вируса гриппа в аллантоисной жидкости зараженного РКЭ с помощью реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами кур. Куриные эмбрионы вскрывают, аллантоисную жидкость отсасывают пастеровской пипеткой, титруя ее в лунках пластикового планшета в разведениях от 1:10 до 1:512 в объеме 0,5 мл. В каждую лунку добавляют 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур, выдерживают при комнатной температуре в течение 40 минут, после чего производят учет. Контролями служат незараженная аллантоисная жидкость и физиологический раствор. Наличие гемагглютинации в опыте при отсутствии ее в контролях указывает на наличие ви­руса в исследуемой жидкости.

4. Идентификация вирусов:

• выявление типа вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости РКЭ с помощью РТГА. (нейтрализация гемагглютинирующей активности различных типов вируса гриппа А, В, С соответствующими противогриппозными диагностическими сыворотками). Отсутствие гемагглютинации с одной из противогриппозных сывороток указывает на тип вируса гриппа;

• выявление вирусов с помощью реакции преципитации в геле (демонстрация). В одну из лунок в агаровом геле вносят исследуемый материал от больного, а в другую – диагностическую сыворотку, содержащую соответствующие антитела. В месте встречи вируса и антитела формируется преципитат в виде белых линий;

• реакция нейтрализации (демонстрация). Производят заражение РКЭ, культур клеток или экспериментальных животных (в зависимости от свойств вируса) смесью вируссодержащего материала (материал от больного, хорион-аллантоисная жидкость РКЭ, надосадочная жидкость зараженной культуры ткани) и соответствующих диагностических противовирусных сывороток. В качестве контроля используется биологический объект (РКЭ, культура ткани, экспериментальное животное), зараженный только вируссодержащим материалом. Контрольное животное, в организме которого ви­рус не нейтрализуется антителами сыворотки, погибает. Опытное животное выживает, так как антитела сыворотки нейтрализуют вирус.

5. Серологический метод диагностики вирусных инфекций (выявление антител в сыворотке крови больных - ретроспективная диагностика)

• РСК при аденовирусной инфекции. Ставится с целью опре­деления антител и их титра в сыворотке крови больных на 2 и 8 день болез­ни.

• Цветная проба при полиомиелите (демонстрация). Сущность реакции состоит в изменении цвета среды, на которой культивируется культу­ра ткани, в результате выделения кислых продуктов метаболизма, что приводит к изменению исходного красного цвета индикатора среды (феноловый красный) на желтый. У зараженных вирусом клеток выделения метаболитов не происходит, поэтому изменения цвета среды не происходит. Схема опыта: к разным разведениям исследуемой сыворотки добавлено 0,1 мл вакцинного штамма вируса полиомиелита, смесь внесена в пробирки с культурой ткани. После 8-10-дневной инкубации в термостате проводят учет реакции по наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдается из­менение цвета среды с красного на желтый.

• РНГА (демонстрация) - определение антител к вирусу гепатита В.

• PТГA (демонстрация) - определение антител в сыворотке крови больного клеще­вым энцефалитом. Реакция основана на способности некоторых вирусов склеивать эритроциты птиц, морских свинок, I (0) группы крови человека. К известному гемагглютинирующему вирусу добавляют исследуемую сыворотку крови. Если в исследуемой крови содержатся антитела, они нейтрализуют гемагглютинирующую активность вируса и агглютинации вирусов не наступает. Схема опыта: к разным разведениям сыворотки крови больного добавляют антиген вируса клещевого энцефалита и взвесь эритроцитов. После экспозиции в течение 40 мин проводят учет реакции по наибольшему разведению сыворотки крови больного, вызвавшему торможение агглютинации эритроцитов.

• ИФА (демонстрация) – определение антител к ВИЧ.

Тема 14. ВИРУСЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ ГРИППА И ОРВИ. ПАРАМИКСОВИРУСЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ КОРИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА. ВИРУСЫ, ПОРАЖАЮЩИЕ КОЖУ И СЛИЗИСТЫЕ ОБОЛОЧКИ (ПОКСВИРУСЫ, ГЕРПЕСВИРУСЫ). КОРОНАВИРУСЫ

Вирусологическая диагностика острых респираторных вирусных инфекций и гриппа

Грипп – это острое инфекционное заболевание, протекающее с выраженной общей интоксикацией и поражением респираторного тракта, возбудителями которого являются РНК-содержащие вирусы семейства Ortho-myxoviridae (род Influenzavirus, типы А, В и С).

Возбудителями ОРВИ являются разнообразные многочисленные вирусы (более 200), вызывающие у людей катар верхних дыхательных путей с различной степенью интоксикации. Наиболее часто ОРВИ вы­зывают вирусы парагриппа, аденовирусы, реовирусы, коронавирусы, риновирусы, энтеровирусы,.

Лабораторная диагностика гриппа и ОРВИ состоит из экспресс-методов, выделения вируса, серологического исследования и метода генодиагностики (ПЦР) - схема 19.

Материалами для исследования при гриппе служат смывы из носоглотки, отде­ляемое слизистой оболочки носа, кро­вь, спинномозговая жидкость, трупный материал. При ОРВИ, вызванных вирусами парагриппа, РС вирусом, корона-, рео- и аденовирусами, исследуемым материалом являются носоглоточные смывы и отделяемое слизис­той оболочки задней стенки глотки, взятое ватным тампоном. Адено-, энтеро- и реовирусы удается обнаружить в крови, моче, фекалиях, трупном материале, а энтеровирусы в спин­номозговой жидкости.

Схема 19. Вирусологическая диагностика гриппа и ОРВИ

Материал для исследования:смывы из носоглотки, отде­ляемое слизистой оболочки носа, кро­вь, спинномозговая жидкость, трупный материал

Вирусологический метод: заражение РКЭ, культур клеток. Индикация вирусов: РГА, ЦПД, РИФ, Р.гемадсорбции. Идентификация:РТГА, РСК, РН, ИФА, РТГадс

Серологический метод: определение антител в парных сыворотках крови больных гриппом с помощью РСК, РТГА, ИФА, РРГ, РН.

Генодиагностика: ПЦР.

Экспресс-диагностика: РИФ, РНОГА, ИФА – выявление вирусных антигенов в исследуемом материале

Экспресс-диагностика направлена на выявление в исследуемом материале антигенов вирусов

Экспресс-диагностика гриппа и ОРВИ основана на выявлении антигенов вирусов с помощью прямой и непрямой РИФ. Положительная реакция характеризуется наличием в клетках эпителия скоплений антигена вируса с ярким зеленым свечением. Реже применяются РОНГА и ИФА.

Выделение вируса при гриппе проводится на РКЭ или на культуре клеток (почек обезьян, фибробластов эмбриона человека или кур; в последние годы используется культура клеток легких собаки - MDSK, обладающая высокой чувствительностью к вирусу гриппа). Поскольку с 4 дня болезни содержание вируса гриппа в организме резко снижается, вирусологическое исследование необходимо выполнять в первые дни инфекции.

Исследуемый материал, обработанный антибиотиками, вводят по 0,2 мл 10—11-днев­ным куриным эмбрионам в полость амниона и аллантоиса. После инкубации эмбрионов в течение 3-4 дней при температуре 37⁰ С, их вскрывают и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем или пастеровской пипеткой, амниотическую — шприцем с короткой иглой. Индикацию вируса гриппа в указанных жидкостях проводят с помощью РГА с 1% взвесью куриных эритроцитов. Индикацию вируса в культуре клеток осуществляют по ЦПД, а также с помощью РИФ и РГадс с эритроцитами морской свинки.

При ОРВИ выделение вирусов обычно проводится на первично-трипсинизированных и перевиваемых культурах ткани различного происхождения. Наличие вируса в клетках культуры ткани определяют по его цитопатическому действию, которое у вируса парагриппа и РС вируса проявляется образованием синцития, а у аденовирусов и реовирусов - появлением зернистости и включений в цитоплазме.

Идентификацию вирусов гриппа и ОРВИ выполняют с помощью РТГА, РСК, РН, ИФА, РТГадс.

Серологический метод заключается в определении антител в парных сыворотках крови больных гриппом с помощью РСК, РТГА, ИФА, РРГ, РН. Нарастание титра антител в 4 и более раз подтверждает диагноз гриппа.

Генодиагностика. Для диагностики гриппа разработана ПЦР.