Основные методы лабораторной диагностики протозойных инфекций

Микроскопический метод направлен на выявление па­разитов в нативных и окрашенных препаратах. Материалом для исследования служат кровь, пунктаты грудины или лимфатических узлов, спинномозговая жидкость, соскоб с кожных элементов, фекалии, дуоденальное содержимое, отделяемое слизис­той оболочки наружных половых органов или мочеиспускательного канала. Простейшие можно обнару­жить как в мазках, так и в гистологических препаратах, изготовленных из поражен­ных тканей. Разработано значительное число методов окраски простейших, среди которых наиболее часто применяется метод Романовского-Гимза.

Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на среды, содержащие кровь или нативную сыворотку, яичный белок, углево­ды, аминокислоты и другие вещества (рН сред 7,0-7,6). Культивирование большинства простейших осуществляют обычно при 37⁰ С, лейшманий и трипаносом при 20-26⁰ С. Результаты посевов учитывают визуально и микроскопическим методом ( препарат «раздавленная» капля) через 24, 48, 72, 120 часов. Дизентерийные амебы, балантидии, трихомонады, хиломастиксы проще выявить микроскопическими методами, однако при необходимости применяют культуральное исследование.

Серологический метод при протозойных инфекциях имеет вспомогательное значение. Применяется РА (американский трипаносомоз), РП (американский трипаносомоз, амебиаз), РСК (американский трипаносомоз, токсоплазмоз, висцеральный лейшманиоз, амебиаз), РИФ (американский трипаносомоз, малярия, токсоплазмоз, висцеральный лейшманиоз, амебиаз), РНГА (ток­соплазмоз), ИФА (токсоплазмоз, тропическая малярия, амебиаз, кожный и висцеральный лейшманиозы, американский трипано­сомоз).

Аллергический метод – кожные аллергические пробы применяются редко, обычно для под­тверждения диагноза кожного лейшманиоза (проба с лейшманином, реакция Монтенегро) и токсоплазмоза (проба с токсоплазмином).

Биологический метод (биопроба) применяется для подтверждения диагноза ряда протозоо­зов, а также в научных целях. Чувствительными животными для дизентерийных амеб и балантидий являются 2-3-недельные крысята, морские свинки, котята, щен­ки, золотистые хомячки; для лямблий — мыши; для лейшманий белые мыши и хомяки; для американских трипаносом - морские свинки; для африканских трипаносом – мартышки; для токсоплазм - белые мыши. Заражение животных осуществляют па­рентерально, в слепую кишку при лапаротомии, через длинный пластмассовый зонд или путем скармливания животным исследуемого материала.

В течение 30 дней после заражения микроскопическому исследованию подвергают кровь животных, мазки-отпечатки из органов или гистологические препараты из пора­женных тканей.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРОТОЗОЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Малярия

Возбудителями тропической малярии является Plasmodium falciparum, трехдневной малярии - Plasmodium vivax, четырехдневной ма­лярии - Plasmodium malariae и трехдневной или овале-малярии - Plasmodium ovale. Малярийные плазмодии претерпевают половой цикл развития в организме комара рода Anopheles и бесполый цикл (шизогония – рис.41) — в орга­низме человека, поражая сначала клетки печени (тканевая шизогония), а затем эритроциты (эритроцитарная шизогония).

Микроскопический метод. Кровь на наличие плазмодиев малярии исследу­ют на стадии эритроцитарной шизогонии путем микроскопии обычных мазков и толстой капли, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Плазмодии, ци­топлазма которых окрашена в голубой цвет, а ядро в вишнево-красный, находят в эритроцитах.

Бесполые (эритроцитарные) формы па­разитов имеют некоторые морфологические особенности. В частности, мерозоит представляет собой круглую или овальную форму с небольшим участком цитоплазмы около ядра; кольцевидный трофозоит - одноядерную форма с уз­ким ободком цитоплазмы, окружающим небольшую вакуоль; амебовидный трофозоит - одноядерную форму с различным количеством и величиной псевдоподий; шизонт содержит два или несколько ядер; морула характеризуется полным разделением ядра и цитоплазмы на мерозоиты.

Половые формы плазмодиев (гаметоциты или гамонты) не содержат вакуолей и псевдоподий. Мужские (микрогаметоциты) и женские (макрогаметоциты) формы отличаются по величине и структуре ядра, интенсивности окраски цитоплазмы и размерам.

При микроскопии тонкого мазка при малярии находят обычно кольцевидные трофозоиты. У P. vivax, P. malariae, P. оvale они имеют размеры от 2 до 4 мкм, занимают около 1/3 диаметра эритроцита. Ядра у трофозоитов P. vivax и P. malariae круглые, у P. ovale — неправильной формы, крупные; ободок ци­топлазмы ровный, неширокий, суживается к ядру. Молодые кольцевидные трофозоиты P. falclparum мелкие (1,25-1,50 мкм), занимают примерно 1/6 часть диаметра эритроцита, имеют маленькое круглое ядро с тонким ободком цитоплазмы. Взрослые кольцевидные трофозоиты более крупные, занимают 1/3 диаметра эритроцита, ободок цитоплаз­мы толстый, резко суживающийся к ядру.

Амебовидные трофозоиты P. vivax отличаются разнообразием форм, размеров, наличием одной или нескольких псевдоподий, вакуолей, круглого или овального ядра, пигмента в виде темно-коричневых цитоплазматических зерен различной величины и формы. Амебовидные трофозоиты P. malariae округлые и овальные (нередко в виде ленты поперек эритроцита с продолговатым или вытянутым ядром), с короткими и широкими псевдоподиями, более темной цитоп­лазмой и пигментом, ядром непра­вильной формы.. Аме­бовидные трофозоиты P.falciparum в виде круглых или

Рис. 41. Основные стадии эритроцитарной шизогонии малярийных плазмодиев

205

овальных форм лишены вакуоли, имеют ядро круглой или неправильной формы, пигмент черного цвета, расположенный компактно, однако они, как правило, в периферической крови не обнаруживаются. Мо­лодые трофозоиты P. ovale имеют кольцевидную форму, бо­лее взрослые сходны с P. malariae.

Размеры шизонтов у возбудителей малярии увеличиваются по нарастающей в ряду P.vivax, P. ovale, P.falciparum.

Морула P. vivax содержит обычно от 14 до 16 беспорядочно расположенных мерозоитов, между которыми лежат глыбки пигмента. В моруле P. malariae около 8 крупных мерозоитов, расположенных в виде розетки; в моруле P.falciparum 8-24 мелких мерозоитов, занимающих часть эритроцита; в моруле P. ovale около 8 крупных мерозоитов с ядром неправильной формы. Гаметоциты Р. vivax (крупные), P. malariae (мелкие) и Р. ovale округлой или овальной формы; глыбки пигмента крупные, равномерно расположены в цитоплазме гаметоцитов. В женских гаметоцитах у края цитоплазмы обнаруживают компактное ядро темно-голубого цвета. Расположенное центрально ядро мужских гаметоцитов розовато-фиолетового цвета, крупное, рыхлое. Га­метоциты этих видов плазмодиев появляются и ис­чезают из периферической крови вместе с трофозоитами. Гаметоциты P.falciparum имеют характерную полулунную форму с ядром, расположенным в средней части цитоплазмы (у женских форм оно небольшое и компактное, у мужских - крупное и рыхлое). Пигмент окружает ядро в виде коротких палочек. Стадия развития гаметоцитов P.falciparum в эритроците существенно превышает длительность шизогонии. Эти гаметоциты выявляются в перифе­рической крови на 8-10 день после появления кольцевид­ных трофозоитов, продолжая поступать в кровь через несколько недель после их исчезновения на фоне отсутствия клинических симптомов малярии..

Эритроциты, пораженные P. vivax и P. ovale, увеличиваются в диаметре до 10-12 мкм, хуже окрашиваются по Романовскому —Гимзе; эритроциты, пораженные P. ovale, могут приобретать неправильную форму, иметь бахромчатый край. Морфология эритроцитов, содер­жащих P. malariae и P. falciparum, не меняется.

В эритроцитах, содержащих P. vivax на различных стадиях раз­вития, выявляются множественные мелкие азурофильные зерна (зер­нистость Шюффнера), при наличии в эритроцитах P. ovale зерна редкие и крупные (зернистость Джеймса), при обнаружении в эритроцитах кольцевидных трофозоитов P.falciparum можно выявить не­большое количество крупных азурофильных зерен (зернистость Маурера), а в тех случаях, когда возбудителем является P. malariae, в эритроцитах выявляют мелкую зернистость Циманна.

Морфология возбудителей малярии в толстой капле. Кольцевид­ные трофозоиты P. vivax, P. ovale, P. malariae обычно имеют оди­наковую величину, однако в толстой капле они часто дефор-

206

мируются, превращаясь в форму запятой или восклицательного знака; цитоплазма при этом концентрируется около ядра в виде округлого или треугольного комочка. Наряду с кольцевидными трофозоитами можно найти другие формы плазмодиев и определить вид воз­будителя.

Аналогичные превращения происходят и с кольцевидными трофо­зоитами P. falciparum, часть из которых сохраняет свою форму. Цитоплазма может разрываться, располага­ясь с двух сторон от ядра в виде «крыльев ласточки», нередко находят раздвоенные ядра. На других стадиях развития плазмодии малярии в периферической крови обычно не выявляются.

Для амебовидных трофозоитов P. vivax в толстой капле характерна деформация их цитоплазмы в виде двух или нескольких комочков, располагающихся около ядра.

Трофозоиты P. malariae в мазке выглядят как компакт­ные овальные или округлые образования с большим количеством пигмента.

На стадии морулы различные виды плазмодиев имеют разное количество мерозоитов и форму морулы. У P. malariae в толстой капле морула сохраняет форму розетки, шизонты и морулы P. ovale напоминают аналогичные формы P. malariae, однако ядро более крупное, пигмента меньше, встреча­ются неразрушенные пораженные эритроциты. При малярии, выз­ванной P. vivax, пораженные эритроциты так же не всегда раз­рушаются, сохраняется зернистость Шюффнера. У P. ovale, в отличие от P. vivax, ядра крупные, неправильной формы, отсутствуют крупные «разорванные» амебовидные трофозоиты, мерозоиты круп­ные и их меньше в моруле.

Женские гаметоциты (гамонты) P. vivax и P. malariae в толстой капле не удается отличить от взрослых трофозоитов. Мужские га­метоциты имеют крупное ядро, окруженное узким обод­ком бледно-голубой цитоплазмы с рассеянными по ней зернами пигмента. Гаметоциты P. falciparum имеют характерную полулун­ную форму.

Серологический метод - определение антител к плазмодиям малярии с помощью РИА или ИФА с диагностическими целями проводится редко.

Генодиагностика - ПЦР.