Тема 7. Ферменты бактерий. Бактериологический метод исследова­ния. Итоговое занятие по теме "морфология и физиология микробов» Самостоятельная работа студентов.

I. Окончание бактериологического исследования по выделе­нию аэробов из смеси бактерий. Проводится идентификация бактерий – определение их видовой принадлежности на основании изучения наиболее важных фенотипических свойств данного микроорганизма. К основным видовым признакам бактерий относятся:

• морфологические и тинкториальные свойства;

• культуральные свойства – особенности роста микроорганизмов на питательных средах;

• биохимические свойства – наличие у бактерий характерных для данного вида ферментов;

• наличие видовых антигенов;

• чувствительность к видовым бактериофагам;

• продукция определенных факторов патогенности;

• видовая резистентность к химиопрепаратам и антибиотикам.

В последние годы для видовой идентификации бактерий используются биохимические методы (газожидкостная хроматография с целью идентификации бактерий по составу жирных кислот, а также молекулярно-генетические методы, в том числе рестрикционный анализ, гибридизация ДНК, и наиболее часто -полимеразная цепная реакция).

Самостоятельная работа студентов заключается в учете ферментативной активности выделенной культуры. Почернение одной из индикаторных бумажек свидетельствует о выделении сероводорода, покраснение другой - о выделении индола. Применяемый в сре­дах Гисса индикатор ВР (смесь водно-голубого красителя и розоловой кислоты) в кислой среде имеет синюю окраску, в щелочной среде - красную. В средах пестрого ряда отмечают образование кислоты или щелочи, выделение газа, подвижность. С уче­том всех изученных свойств чистой культуры (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических) формулируется заключение о виде выделенного микроорганизма.

2. Ознакомиться с индикаторными бумажными системами (ИБС) для определения ферментативной активности бактерий.

3. Окончание работы по выделению чистой культуры анаэробов из почвы (учет биохимических свойств). Сделать заключение о виде возбудителя.

4. Контроль теоретических знаний (тестовый контроль, опрос) и практических навыков (микроскопия контрольных микропрепаратов с использованием иммерсионной системы и описанием морфологии микроорганизмов) по разделу: «Морфология и физиология микроорганизмов».

Тема 8. Вирусы бактерий (бактериофаги)

Цель занятия: знакомство с морфологией и свойствами бактериофагов, стадиями их взаимодействия с бактериальной клеткой, практическим применением.

Самостоятельная работа студентов

1. Определение коли-фага в фильтрате речной воды (демонстрация). На поверхность пластинчатого МПА «густым га­зоном» засевают культуру кишечной палочки. На посев нано­сят I – 2 капли исследуемого материала – фильтрата. Закрыв чашку Петри крышкой, оставляют посев на столе на 5 минут. За­тем посев ставят на сутки в термостат. В положительном слу­чае в месте нанесения фильтрата наблюдается «стерильное» пят­но.

2. Определение титра коли-фага в жидкой питательной среде по Аппельману (демонстрация). Ряд пробирок содержит по 4,5 мл МПБ. В первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, получая разведение 1:10, затем после перемешивания 0,5 мл материала переносят во вторую пробирку (разведение 1:100) и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл содержимого удаляют. Затем во все пробирки вно­сят по I капле бульонной культуры кишечной палочки и пробирки помещают на 24 часа в термостат. Титр фага определяют по мак­симальному разведению, при котором наблюдается лизис микробов (например 10^-5).

3. Определение титра дизентерийного фага по Грациа (демонстрация). Готовят разведения исследуемого фага от 10^-5 до 10^-7. По 0,5 мл каждого разведения фага смешивают с 0,5 мл бульон­ной культуры дизентерийной палочки (Shigella sonnei). Смесь вно­сят в 3 мл расплавленного и охлажденного до 45⁰ С 5% МПА, пе­ремешивают и выливают на поверхность 3 чашек с МПА. Посевы инкубируют 24 часа в термостате при 37⁰ С. Учитывают количество негативных колоний на единицу объема исходной суспензии фага. Титр фага определяется количеством фаговых частиц в I мл суспензии (табл. 4).

Таблица 4

Расчет титра фага по методу Грациа

Номер пробы	Число «стерильных пятен фага, полученных при посевах проб в разведениях			Число фаговых частиц
	10-5	10-6	10-7
1.	370	42	3	7,3х107
2.	463	50	6	1,0х108
3.	37	4	0	7,7х106

4. Определение спектра литического действия дизентерийного фага (демонстрация). Чашку с МПА делят на 4 сектора. На каж­дый сектор петлей наносят каплю бульонной культуры Sh.sonnei, Sh.dysenteriae, Sh.flexneri, Sh.boydii соответственно и равномерно распределяют по поверхности агара. Затем на каждый сектор наносят по капле исследуемого фага. После инкубации в термостате в тече­ние суток при 37⁰ С выявляют сектора, где имеется лизис бакте­рий или «стерильные» пятна.

5. Фаготипирование культуры золотистого стафилококка (демонстрация). Бульонную культуру стафилококка в количестве 0,5 мл вносят в расплавленный и охлажденный до 45⁰ С 0,7% МПА, пере­мешивают и распределяют по поверхности чашки с 2% МПА. Чашку делят на квадраты, в которые вносят по капле различных типовых стафилококковых фагов. После инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых имеется лизис бактерий и по таблице определяют фаговар культуры.

6. Определение лизогении культуры возбудителя брюшного тифа (демонстрация). Исследуемую культуру засевают на МПБ, через сутки ее центрифугируют. Надосадочную жидкость, содер­жащую свободный фаг, переносят на посев индикаторной брюшно­тифозной культуры в чашке Петри, инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение суток. Если исследуемая культура лизогенная, на посеве индикаторной брюшно­тифозной культуры обнаруживают «стерильные» пятна.

7. Изучение биопрепаратов фага, применяемые для профилактики и лечения (стафилококковый бактериофаг, коли – фаг, сальмонеллезный бактериофаг, коли-протейный фаг, дизентерийный бактериофаг, протейный фаг, брюшнотифозный бактериофаг, стрептококковый фаг, паратифозный бактериофаг, холерный фаг Эль-Тор, холерный фаг классический)

8. Изучение препаратов фагов, применяемых для диагностики инфекционных болезней (индикаторные фаги - демонстрация).