КНОРРЕ_3227

7.3.4. Реакции электрофильного замещения

Реакции электрофильного замещения в белках наиболее характерны для ароматических колец остатков тирозина. В живой природе происходит электрофильное иодирование остатков тирозина, необходимое для образования гормонов щитовидной железы (§ 17.2).

Иодирование используется для введения в белки тяжелой метки для рент­ геноструктурного анализа белков методом изоморфного замещения. Иодиро­ вание радиолактивными изотопами иода I125 и I131 позволяет ввести в белок радиоактивную метку.

В исследовании белков используются две неприродные реакции электро­ фильного замещения - бромирование N-бромсукцинимидом и нитрование тетранитрометаном. N-бромсукцинимид является донором катионов Вг+ Бромирование приводит к введению двух атомов брома. Обе реакции прохо­ дят селективно по ароматическому кольцу остатков тирозина.

0=С

НС- с н 2- ^ у ~

I

NH

7.3.5. Реакции по гуанидиновой группе аргинина

Химические методы модификации остатков аргинина в белках основаны на конденсации гуанидиновой группы с различными дикетонами и диальде­ гидами, проходящей одновременно по двум атомам азота. Наибольшее при­ менение среди них находит реакция с 1,2-циклогексадионом. Модификация протекает в мягких условиях (pH 8,0-9,0, 25-40 °С) в натрий-боратном буфе­ ре с образованием стабильного комплекса производного аргинина с боратом.

О

п

Модифицирующая группировка может быть удалена обработкой 0,5 М гидроксиламином при pH 7,0, 37 °С, что дает возможность проводить после­ дующее расщепление трипсином по освобождающимся остаткам аргинина. Эта реакция используется для раздельного расщепления полипептидной цепи по остаткам аргинина и лизина.

7.3.6. Окислительно-восстановительные реакции

Цистеин, как все тиолы, выступая восстановителем, легко окисляется, об­ разуя цистин, являющийся дисульфидом цистеина и сопряженным ему окис­ лителем.

Таким образом, цистеин и цистин составляют сопряженную восстанови­ тельно-окислительную пару (вопреки правилам, исторически на первое место поставлена восстановительная форма), для которой характерно тиолдисульфидное равновесие. Отрицательное значение восстановительного по­ тенциала этой пары (Е0,= -0,22 В) свидетельствует, что восстановительные свойства у нее преобладают над окислительными. Поэтому благодаря вос­ становительным свойствам тиольной группы цистеин является эффективным

антиоксидантом, выполняя защитные функции при воздействии на организм сильных окислителей.

При радиационном воздействии на живые организмы возникают сильные

окислители ’ОН, вНС>2, Н20 2, *02, называемые активными формами кислоро­ да. Наряду с окислителями при этом воздействии в организме возникают другие токсиканты - короткоживущие сильные восстановители: гидратиро­ ванный электрон ( е ’ ГИд р ) и атомарный водород Н. Компоненты сопряженной восстановительно-окислительной пары цистеин-цистин активно взаимодей­ ствуют и с теми, и с другими агрессивно-токсичными частицами, нейтрали­ зуя их. Большое значение для пространственной структуры белков имеет об­ разование при действии фермента цистеинредуктазы дисульфидных мости­ ков (превращение двух остатков цистеина в остаток цистина). Эта обратимая реакция, кроме того, играет важную роль в регуляции процессов обмена в живых организмах.

Разнообразные окислительно-восстановительные реакции с участием SHгрупп широко используются при изучении белков.

При исчерпывающем окислении тиольной группы цистеина, например, надмуравьиной кислотой, цистеин переходит в цистеиновую кислоту, содер­ жащую сульфогруппу.

SH-группы остатков цистеина легко вступают в реакции дисульфидного обмена.

R1-S-S-R2 + R3-SH «-» RiSH + R2-S-S-R3

В качестве примера можно привести взаимодействие их с 5,5’-дитио- бис(2-нитробензойной) кислотой {реактив Эллмана), при которой в хиноидной форме освобождается 2-нитро-5-меркаптобензойная кислота. Образова­ ние ее легко регистрируется по появлению характерного поглощения в видимой области спектра (максимум при 412 нм), что позволяет по этой реакции определять количество SH-групп в белках.

w ‘NH-CH-COv/vv

Атомы серы остатков этих аминокислот могут в мягких условиях окис­ ляться - остатки цистеина до цистеиновой кислоты,

остатки метионина до остатков метионин сульфоксида, а при использовании сильных окислителей - до метионинсульфона.

§ 7.4. Посттрансляционная модификация белков

Как уже говорилось в § 1.1, после завершения матричного синтеза обра­ зовавшиеся биополимеры в большом числе случаев для приобретения основ­ ной функциональной активности подвергаются дополнительной модифика­ ции. Особенно многочисленны и значимы эти процессы для белков (по­ сттрансляционная модификация). Благодаря указанным модификациям протеома отдельных клеток, тканей и целых организмов значительно превосхо­ дит по численности количество генов, кодирующих весь набор белков.

Важную роль играют посттрансляционные протеолитические процессы. Многие белки для их окончательной локализации в определенных органеллах синтезируются в виде полипептидов, снабженных специальными сиг­ нальными последовательностями. После доставки полипептида в нужную органеллу сигнальный пептид отщепляется с помощью сигнальной протеазы. Кроме того, многие белки образуются в виде пробелков, образование которых обеспечивает формирование необходимой пространственной структуры, пос­

ле чего происходит выщепление излишней части полипептидной цепи.

Вкачестве примера можно привести синтез инсулина. Он образуется в виде препроинсулина в специальных клетках поджелудочной железы (островках Лангерганса), выходит через мембрану эндоплазатического ретикулума с от­ щеплением сигнальной последовательности в виде проинсулина - белка, со­ стоящего из одной цепи длиной 86 аминокислотных остатков с двумя дисульфидными мостиками. На последней стадии образования активного гор­ мона происходит разрыв полипептидной цепи в двух точках с выщеплением не обладающего какой-либо установленной активностью пептида (С-пептид).

Врезультате образуется активный гормон, состоящий из двух цепей (А и В), связанных двумя дисульфидными мостиками (рис. 54).

С-пептид

50 40

L A L P Q L S G A G P G G G L E V Q G V Q L D

Рис. 54. Структура проинсулина (однобуквенный код). Вертикальные черточки и прямоугольная скобка обозначают дисульфидные мостики между остатками цистеина. Стрелками обозначены пептидные связи, разрываемые при превращении про­ инсулина в инсулин. Структура инсулина обведена пунктиром

Другая группа процессов посттрансляционной модификации белков пред­ ставляет собой присоединение к боковым радикалам соединений, придаю­ щих полипептиду новые свойства, отсутствующие у полипептидной цепи. Это прежде всего относится к реакциям присоединения к определенному бо­ ковому радикалу апофермента кофактора, превращающее апофермент в функционирующий катализатор. Функция ряда кофакторов и точки их при­ соединения к апоферментам будут рассмотрены в главе 16.

Важную роль модификация белков играет в регуляции их активности. Для этого наиболее широко используются активности ферментов фосфорилирования. Процесс осуществляется специальными протеинкиназами, кото­ рые катализируют и осуществляют селективный перенос у-фосфата от АТР на ОН-группу остатка серина/треонина (серин/треонин киназы, К.Ф. 2.7.11.1)

166 Глава 7. Биоорганическая химия аминокислот и белков

или остатка тирозина (тирозинкиназы К.Ф. 2.7.10.2). Протеинкиназы, как правило, специфичны к определенному белку-субстрату и модифицируют определенный аминокислотный остаток в этом белке. В связи с узкой специфичностью организму требуется большой набор протеинкиназ. У человека обнаружено до 500 различных протеинкиназ. У бактерий, расте­ ний и грибов широко распространены гистидиновые киназы, которые рабо­ тают как часть двухкомпонентной системы сигнальной трансдукции. Остаток неорганического фосфата, присоединенный к собственному остатку гистиди­ на, затем переносится на остаток аспартата белка-мишени. Фосфорилирование аспартата приводит к дальнейшей передаче сигнала.

Процесс фосфорилирования термодинамически необратим, но в подав­ ляющем большинстве случаев каждой протеинкиназе соответствует опреде­ ленная фосфатаза, катализирующая гидролиз фосфоэфирной связи, образо­ ванной с помощью протеинкиназы. Эти процессы являются одним из основ­ ных механизмов регуляции биохимических процессов. Фосфорилирование одного из ферментов либо превращает немодифицирванный белок в катали­ тически активную форму, либо, наоборот, инактивирует фермент.

В качестве примера можно привести регуляцию фермента гликогенфосфорилазы (К.Ф. 2.4.1.1). Этот фермент катализирует фосфоролиз гликогенаполисахарида, построенного из остатков глюкозы, являющегося у животных организмов основным депо глюкозы (§ 13.5). Гликогенфосфорилаза сущест­ вует в двух состояниях. В одном из них (фосфорилаза а) ее субъединицы фосфорилированы по определенным остаткам серина. В этом состоянии она каталитически активна. Под действием специальной фосфатазы (фосфатаза фосфорилазы а (К.Ф. 3.1.3.17)) она дефосфорилируется и переходит в неак­ тивную фосфорилазу Ъ.

Фосфорилирование может проходить по множеству сайтов. Этому про­ цессу подвергаются функциональные группы различных остатков аминокис­ лот. Множественное фосфорилирование характерно, например, для РНКполимеразы II эукариот. С-концевой домен большой субъединицы содержит значительное количество (у человека 52 копии, у дрожжей - 26-27 копий) повторяющихся гептапептидных последовательностей состава Tyr-Ser-Pro- Thr-Ser-Pro-Ser. Множественное фосфорилирование этих повторов по остат­ кам серина и треонина способствует связыванию с ферментом большого чис­ ла транскрипционных факторов элонгации и ассоциированных с ними бел­ ков, что необходимо для перехода фермента из преинициирующего транс­ крипционного комплекса в устойчивый элонгирующий комплекс, обеспечи­ вающий движение РНК-полимеразы по ДНК в составе хроматина.

Большое регуляторное значение имеет посттрансляционная модификация гистонов в хроматине. Модификация проходит по остаткам лизина и аргини­ на (ацетилирование и метилирование), а также по ОН-группам (фосфорили­ рование). Гистон-метилтрансферазы обладают высокой специфичностью по отношению к природе аминокислотного остатка (гистонлизинметилтрансфе-

разы (К.Ф. 2.1.1.43) и гистон-аргининметилтрансферазы (К.Ф. 2.1.1.125). Рас­ пределение точек модификации определяет функциональное состояние гена в отношении процессов репликации и транскрипции. Это распределение обычно рассматривается как элемент «гистонового кода».

В качестве примера вариантов распределения точек модификации гисто-

нов можно привести пострансляционное ацетилирование белков, которое проходит по е-аминогруппам остатков лизина. Донором ацетильных групп является ацетилкофермент А. При этом исчезает положительный заряд, что приводит к перераспределению заряда всей белковой молекулы, увеличению гидрофобности и размера боковой цепи модифицированной аминокислоты. Это, в частности, служит сигналом связывания с гистонами факторов транкрипции, т. е. инициации процесса транскрипции. Например, разные формы гистон-ацетилтрансферазы (К.Ф. 2.3.1.48) катализируют ацетилирование остатков лизина, расположенных в строго специфических позициях в составе белка. Так, в октамерном ядре нуклеосомы, содержащем по две копии гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, существует 30 консервативных остатков лизина

вN-концевой части белка, способных ацетилироваться (остатки в положени­ ях 5, 9 в Н2А, остатки 5, 12, 15, 20 в Н2В, остатки 9, 14, 18, 23, 27 в НЗ и ос­ татки 5, 8, 12, 16 в Н4). В зависимости от количества и места расположения ацетилированных остатков аминокислоты получается огромное число ком­ бинаций распределения ацетилированных остатков, что играет важную роль

вфункционировании хроматина.

Вслучае лизина в реакциях, катализируемых различными метилтрансферазами, возможно образование моно-, ди-, триметиллизинов, в случае арги­

нина - моно- и диметиларгининов. Полученные соединения отличаются раз­ мерами модифицированного остатка и степенью гидрофобности.

Метилирование белков наиболее изучено на примере модификации гистонов. Метилирование остатков лизина в гистонах играет важную роль в упо­ мянутом выше «гистоновом коде». Наиболее охарактеризованные положения метилирования в гистонах - это Lys4 и Lys9 в гистоне НЗ. Кроме указанных остатков, в гистоне НЗ могут метилироваться выступающие над поверхно­ стью нуклеосомы Lys27, Lys36, Arg2, Argl7 и Arg26, а в гистоне H4 - Arg3.

Метилированию, как и другим описанным выше модификациям боковых групп, соответствует противоположная реакция деметилирования.

Деметилирование лизина является окислительным процессом и может ка­ тализироваться или FAD-зависимой полиаминоксидазой, или лизинспецифичной деметилазой, функционирующей как диоксигеназа в присутст­ вии кофакторов - ионов Fe2+, а-кетоглутарата и аскорбата (К.Ф. 1.5.3.4). Схема процесса приведена на рис. 55.

Рис. 55. Реакция деметилирования ди- и монометилированных остатков лизина в гистонах, катализируемая FAD-зависимой аминооксидазой (вверху), и три-, ди-

имонометилированных остатков лизина в гистонах, катализируемая гистондеметилазой, функционирующей в присутствии кофакторов - ионов Fe2+, а-кетоглутарата

иаскорбата{внизу)

Деметилирование остатка модифицированного аргинина осуществляет ядерная пептидиларгинин деиминаза (К.Ф. 3.5.3.15), превращающая метили­ рованный аргинин в цитруллин.

w»NH—CH—CCVw' w>NH—CH—CO/v v '

Для облегчения взаимодействия белков с мембранами необходимо введе­ ние в белки объемных гидрофобных остатков. Такими процессами являются изопренилирование по остатку цистеина (разд. 7.3.2), миристоилирование аминогруппы N-концевого глицина, пальмитоилирование остатков цистеина

ацильными радикалами миристиновой и пальмитиновой кислот. Донором ацильного остатка являются соответствующие ацил-СоА.

Важное биологическое значение имеет ацилирование белков активиро­ ванной С-концевой карбоксильной группой остатка глицина убиквитина (8 кДа), состоящего из 76 аминокислотных остатков (убиквитинширование). Главная, хотя и не единственная, функция этого процесса заключается во вве­ дении метки в белки, подлежащие уничтожению. К ним относятся различные поврежденные белки и нормальные белки, которые должны выполнять свою функцию в определенной фазе развития клетки, и присутствие их за преде­ лами этой фазы нежелательно.

Конъюгация белка-мишени с убиквитином включает три стадии. Первая представляет собой активацию карбоксильной группы убиквитина с помощью убиквитин-активирующего фермента Е1 и АТР с образованием убиквитил-АМР. На второй стадии остаток убиквитина переносится на SHгруппу убиквитин-переносящего белка Е2. На третьей стадии убиквитинпротеин лигаза ЕЗ катализирует перенос убиквитильного остатка на белко­ вый субстрат с образованием амидной связи между С-концевым остатком глицина убиквитина G76 и остатком лизина белка-мишени (субстрата). Мо­ дифицированный остатком убиквитина белок подвергается протеолизу в протеасомах или лизосомах (рис. 56).

Если Е1 представлен в клетке единственным ферментом, то фермент Е2 в клетках млекопитающих имеет уже 20-40 изоформ, а для ЕЗ фермента су­ ществуют сотни изоферментов.

На молекулу белка-мишени может переноситься как один остаток убик­ витина, так и несколько. На рис. 56 такой продукт обозначен как субстратUbn. При полиубиквитилировании субстрата фрагмент убиквитин, непосред­

Рис. 56. Схема введения остатка (остатков) убиквитина в белок-субстрат: E1-SH - убиквитин-активирующий фермент, E2-SH - убиквитин-переносящий белок, ЕЗ - убиквитин-протеин лигаза, Ub - остаток убиквитина

Lys-48 или Lys-63 С-концевым остатком глицина следующей молекулы уби­ квитина. При образовании ковалентного адцукта у присоединенного фраг­ мента убиквитина сохраняется способность к конъюгированию вышеназван­ ных лизинов со следующего остатком убиквитина, что в конечном счете при­ водит к полиубиквитилированию белка-субстрата (рис. 57).