КНОРРЕ_3227

оон

0 - Р = 0

Рис. 50. Типы реакций нуклеофильного замещения: X - нуклеофильный атом бо­ кового радикала аминокислотного остатка, Y- уходящая группа; R - спейсер

Существует два основных механизма, по которым протекают реакции нуклеофильного замещения: SW1 и Sn2. 5V1-реакция - мономолекулярное нук­ леофильное замещение, протекающее через образование промежуточного соединения (карбокатион). Процесс в этом случае является двухстадийным. 5д/2 - бимолекулярное нуклеофильное замещение, т. е. одностадийная реак­ ция, в которой исходное соединение и продукт разделяет только переходное состояние. По механизму SN2 протекают, например, реакции замещения

усульфоний-иона, приводящие к переносу метильной группы от атома серы

катакующему нуклеофилу.

Следует обратить внимание, что нуклеофильная атака метильной или другой алкильной группы протекает легко только в том случае, если атом углерода присоединен к какому-либо атому, несущему положительный заряд. Реакция замещения у сульфоний-иона, приводящая к переносу метильной группы от атома серы к атакующему нуклеофилу, называется реакцией трансметилирования. Трансметилирование - важный метаболический про­ цесс, который катализируется ферментами метилтрансферазами.

§ 7.3. Химическая модификация функциональных групп белков_______ 151

отличаются размерами модифицированного остатка и степенью гидрофобности.

Карбоксильные группы остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот могут подвергаться этерификации при действии галоидалкилов, например йодуксусной и броуксусной кислотами.

Эти же реагенты могут осуществлять алкилирование ОН-групп остатков гидроксиаминокислот.

Еще один пример .^-замещения у насыщенного атома углерода - реак­ ции галогенкарбоновых кислот с боковыми радикалами лизина и цистеина. По другому механизму, т. е. 5^1, могут протекать реакции, при которых воз­ можно образование устойчивого промежуточного катиона. К этому типу ре­ акций относятся также реакции с участием соседней группы. Если в одной и той же молекуле имеется хороший нуклеофил (например, О, S или N) и ухо­ дящая группа и они разделены двумя атомами, то может произойти внутри­ молекулярное замещение уходящей группы. На второй стадии внешний нук­ леофил (функциональная группа белка) замещает внутренний нуклеофил у того углеродного атома, с которым он связывается. Реакция соседней груп­ пы описанного типа приводит в целом к сохранению конфигурации атома углерода, связанного с уходящей группой. Характерный пример участия со­ седней группы мы находим в реакциях горчичного газа \бис-(2- хлорэтил)сульфида или иприта] или его азотистого аналога.

Горчичный газ отличается сильным кожно-нарывным действием и явля­ ется токсичным при концентрации в воздухе 1 м. д. (миллионная доля). Его высокая реакционная способность и токсичность связаны с эффектом уча­ стия соседней группы. Способность к легкому раскрытию кольца при нук­

леофильной атаке делает трехчленные кольца сильнейшими алкилирующими агентами. Это свойство успешно используется в лекарственных препаратах при химиотерапии злокачественных опухолей. Алкилирующие агенты явля­ ются одной из самых распространенных групп из всех применяемых в на­ стоящее время противоопухолевых препаратов. Первыми алкилирующими агентами, использовавшимися в терапии злокачественных заболеваний сразу после Второй мировой войны, были иприт и его азотистый аналог. Однако недостаточная избирательность действия лимитировала их использование. В связи с этим были созданы модифицированные, более селективно дейст­ вующие алкилирующие препараты - соединения латентной активности, к ним относится, например, циклофосфан. Образование активной формы дан­ ного препарата происходит в результате действия оксидаз микросом:

Реакции алкилирования в мягких условиях проходят по атомам серы ос­ татков цистеина и метионина. Они, в частности, используются для защиты остатков цистеина при проведении кислотного гидролиза белков до амино­ кислот (см. § 7.1) и для расщепления полипептидной цепи по остаткам ме­ тионина (§ 8.1). Алкилирование остатков цистеина этиленимином приводит к превращению его в остаток аминоэтилцистеина, являющийся структурным аналогом остатка лизина, в результате чего по этим остаткам происходит спе­ цифичное расщепление трипсином:

По механизму <SV1 может протекать также такая постгрансляционная мо­ дификация, как изопренилирование белков, при котором происходит перенос остатка изопреноида (фарнезила (и = 2) или геранилгеранила (и = 3)) от пи­ рофосфата на остаток цистеина белка. Возможность протекания реакции по

механизму 5V1 при изопренилировании белков обусловлена тем, что в случае элиминирования хорошей уходящей группы - остатка пирофосфата образу­ ется карбокатион, стабилизированный за счет сопряжения вакантной орбита­ ли СТТ-СВЯЗЬЮ.

Ферменты, переносящие изопренильные остатки, являются металлоэнзимами, содержащими один ион Zn2+ на димерную молекулу фермента. В по­ следовательностях -Cys-Cys-X-X оба цистеиновых остатка могут подвергать­ ся модификации остатками геранилгеранила. Такой белок, обладая большим сродством к липидным мембранам, служит уникальным местом опознавания для некоторых белок-белковых взаимодействий.

По механизму нуклеофильного замещения проходят реакции гликозильных остатков. Это касается в первую очередь таких реакций, как гликозилирование белков, и реакций ADP-рибозилирования. Атакующей частицей в этих процессах являются стабилизированный карбоний ион.

Гликозилирование белков рассматривается в главе 14, посвященной угле­ водам. ADP-рибозилирование является одним из важных регуляторов про­ цессов репарации ДНК. Донором ADP-рибозильного остатка является NAD+ Положительно заряженная никотинамидная группа отщепляется под дейст­ вием ADP-рибозилтрансфераз и образуется рибооксокарбониевый катион, который взаимодействует с различными нуклеофильными группами белков. Постгрансляционной модификации подвергаются функциональные группы таких аминокислот, как гистидин, цистеин, аргинин, аспарагин (рис. 51).

Во многих клеточных процессах, таких, например, как репарация ДНК, апоптоз и др., обратимое моно- и полиАЭР-рибозилирование используется в качестве важного механизма регуляции процессов. Многие патогенные бак­ терии секретируют токсины, которые ADP-рибозилируют белки человека, вызывая различные болезни: холеру, дифтерию, коклюш, ботулизм.

Так, в iV-концевой части мембранного клеточного рецептора хемокина человека (регулятора противовоспалительных иммунных реакций), имеюще­ го большое значение для эмбрионального развития и иммунного ответа, три остатка тирозина Туг7, Туг12, Туг21 подвергаются посттрансляционному сульфированию в аппарате Гольджи, что увеличивает сродство рецептора к своему лиганду - хемокину SDF-la. Соответственно в лизосомах обнару­ жены ферменты, катализирующие гидролиз сульфоэфиров - сульфатазы.

7.3.3. Реакции нуклеофильного присоединения-отщепления (элиминирования)

Реакции, которые будут рассмотрены в этом параграфе, формально объе­ динены тем, что все они начинаются с присоединения нуклеофильных групп белков по карбонильной группе. К ним относятся реакции ацилирования и образования оснований Шиффа. Эти реакции проходят через промежуточ­ ное образование тетраэдрического интермедиата. Общее направление реак­ ции определяется затем судьбой этого интермедиата. На рис. 53 приведена обобщенная схема реакций ацилирования, характерных для функциональных групп белков. Ацилирующими агентами могут быть тиоэфиры, активирован­ ные эфиры (пентфторфениловые, N-оксисукцинимидные эфиры), смешанные ангидриды с фосфорной кислотой и ее эфирами.

0=С о 0=С ОН 0=С о

HC-R-X: + С—Y — ► H C -R -X -C -Y — ► H C -R -X -C -R h+ HY

Подвергаются остатки: Lys, His, Tyr

О

Реагенты:

R^i C“ S R2

Оo

II II

R r C - 0 - P l- 0 - R 2

0-

Рис. 53. Реакция нуклеофильного присоединения-отщепления: X - нуклеофиль­ ный атом бокового радикала аминокислотного остатка, У - уходящая группа; R -

спейсер, Rh R2- углеводородные радикалы

При наличии относительно хорошо уходящих групп, таких как феноляты или кислые спирты (например, этилмеркаптан), медленной стадией является отрыв от биполярного тетраэдрического интермедиата уходящей группы (см. рис. 53). Это имеет место в том случае, если такой группой является фенолятанион или тиолат. В качестве примера реакции, протекающей по механизму присоединения-отщепления с участием реагента с хорошей уходящей груп­ пой, может служить взаимодействие аспирина с ферментом.

Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счет ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате реакции присоединения-отщепления ацетиль­ ный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой ОН-группе серина (Ser-530) в активном центре циклооксигеназы тромбоцитов человека.

При наличии менее легко уходящей группы распад тетраэдрического ин­ термедиата проходит только после образования анионной частицы. Для та­ ких систем стадией, определяющей скорость реакции, является перенос про­ тона. Взаимодействие алифатической аминогруппы (например, ^-амино­ группы лизина) со сложными эфирами часто обнаруживает влияние общего основного катализа. Депротонирование облегчает распад тетраэдрического интермедиата, так как повышенная электронная плотность на атоме азота благоприятствует отрыву аниона.

По механизму нуклеофильного присоединения-элиминации проходит об­ разование оснований Шиффа. Реакция протекает в две стадии. На первой происходит нуклеофильное присоединение аминогруппы к карбонильной груп­ пе с образованием карбиноламина, за которым следует отщепление воды.

где R/ и R2 - углеводородные радикалы, в случае альдегидов вместо одного из радикалов находится атом Н.

Реакции образования оснований Шиффа между е-аминогруппами остат­ ков лизина с пиридоксальфосфатом широко используются для установления роли остатков лизина в функционировании ферментов.

I

НС—(СН2)4— nh2 +

+ Н20

Основания Шиффа образуются быстро (часто в течение долей секунды), но не мгновенно, и для достижения скоростей, характерных для фермента­ тивных реакций, необходимо, чтобы одна или обе стадии реакции протекали с участием катализаторов.

Реакции ацилирования по е-аминогруппам остатков лизина позволяют блокировать действие специфичных к остаткам основных аминокислот на белки (например, трипсина) на связи, образованные лизином, и дает возмож­ ность расщеплять белки избирательно только по остаткам аргинина. Ацилирование ангидридами дикарбоновых кислот приводит к замене положитель­ ного заряда остатка лизина на отрицательный заряд полуамида дикарбоновой кислоты. В зависимости от природы используемого реагента модификация остатков лизина может быть как обратимой, так и необратимой. Обратимое блокирование 8-аминогрупп позволяет осуществлять последовательное рас­ щепление белковой молекулы трипсином: вначале только по остаткам арги­ нина, а затем, после разделения образовавшихся пептидов и удаления защит­ ных групп, и по остаткам лизина. Для обратимой модификации чаще всего используется реакция с малеиновым или цитраконовым ангидридами. Реак­ ция ацилирования проводится при pH 8,5-9,0 и температуре 0-+2 °С в при­ сутствии 20-кратного избытка реагента. Малеильные производные лизина стабильны при нейтральных и щелочных значениях pH, а в кислой среде (pH 3,5; 40 °С; 40 ч) гидролизуются, регенирируя свободную е-аминогруппу. В этих условиях может происходить частичное дезамидирование белков,