КНОРРЕ_3227

/note="codon recognized: GUC; Val-tRNA-

ggtttcgtgg tctagtcggt tatggcatct gcttgacacg cagaacgtcc ccagttcgat cctgggcgaaatcacca//

Рис. 26. Последовательность нуклеотидов, положение и природа миноров для валиновой тРНК-I из пекарских дрожжей РНК (по данным Genbank)

В качестве еще одного примера на рис. 27 приводится запись для мРНК, кодирующей человеческую панкреатическую рибонуклеазу. В случае мРНК наряду с ее нуклеотидной последовательностью приводится кодируемая по­ следовательность аминокислот (продукт трансляции).

cationic protein) (RNASE3), mRNA.

/translation-'

MVPKLFTSQI CLLLLLGLMG VEGSLHARPP QFTRAQWFAI QHISLNPPRC TIAMRAINNY RWRCKNQNTF LRTTFANVVN VCGNQSIRCP HNRTLNNCHR SRFRVPLLHC DLINPGAQNI SNCTYADRPG RRFYVVACDN RDPRDSPRYP VVPVHLDTTI"

ORIGIN

Рис. 27. Последовательность нуклеотидов в мРНК, кодирующей панкреатиче­ скую рибонуклеазу

Помимо выведенной на экран компьютера последовательности выдается и различная дополнительная информация (гл. 20).

Глава 4. Пространственная структура нуклеиновых кислот. Ее значение для функционирования нуклеиновых кислот

§ 4.1. Двуспиральные нуклеиновые кислоты. А-, В- и Z-формы нуклеиновых кислот. Суперспирализация

4.1.1. Уотсон-криковские взаимодействия

Существуют две основные биологически значимые пространственные структуры нуклеиновых кислот. ДНК, как уже говорилось в § 1.3, находится преимущественно в двунитевой форме. Это касается не только ДНК основно­ го генома прокариот и эукариот, но и ДНК в составе митохондрий и хлоропластов, в плазмидах, а также ДНК многих вирусов, таких как бактериофаги Т2, Т4, Т7. В то же время среди вирусов встречаются и такие, у которых на­ следственная программа представлена однонитевой ДНК. Эта ДНК не может обеспечить размножение вирусных частиц - синтез новых однонитевых мо­ лекул вирусной ДНК может происходить только при участии комплементар­ ной ДНК. Поэтому в клетке, инфицированной вирусом, содержащим однонитевую ДНК, первоначально с использованием вирусной ДНК в качестве мат­ рицы происходит синтез такой комплементарной ДНК. При этом формирует­ ся двунитевая репликативная форма ДНК, состоящая из вирусной и компле­ ментарной цепей. Последняя в дальнейшем служит матрицей для многократ­ ной репликации с образованием необходимого числа копий вирусной ДНК.

В противоположность ДНК для большинства видов РНК характерна однонитевая структура. Это относится ко всем трем перечисленным в § 1.3 главным видам рибонуклеиновой кислоты, мРНК, рРНК и тРНК, образую­ щимся в живых организмах путем транскрипции соответствующих генов. Однонитевые РНК являются носителями генетической информации многих вирусов животных, растений и микроорганизмов, в частности, ряда вирусов, вызывающих опасные заболевания человека - клещевой энцефалит, бешен­ ство и ряд других. Из растительных вирусов наиболее детально изучен вирус табачной мозаики, содержащий в качестве наследственной программы моле­ кулу РНК. Однонитевые РНК входят в состав ряда бактериофагов, таких как R17, QP. У всех этих вирусов механизм размножения основан на том же принципе, что и механизм размножения вирусов, содержащих однонитевую ДНК: сначала под действием специального фермента образуется молекула РНК, комплементарная вирусной РНК, а затем образовавшиеся двунитевые РНК функционируют в качестве матриц для производства множества моле­ кул вирусной РНК, которые формируют новые вирусные частицы. Однони-

тевые РНК входят также в состав ретровирусов (см. § 1.9), которые начинают свой цикл размножения с обратной транскрипции с помощью входящей в состав этих вирусов обратной транскриптазы, создающей копию ДНК.

Известно некоторое число вирусов, у которых в составе вирусных частиц уже содержатся двунитевые РНК.

Определяющее значение для конформации полинуклеотидной цепи име­ ют взаимодействия гетероциклических фрагментов. Они могут быть весьма многообразны, однако для структуры ДНК по своей значимости резко выде­ ляются Уотсон - Криковские взаимодействия, которые получили название по имени установивших их авторов (James Watson, Francis Crick) - это взаи­ модействия между тимином или урацилом и аденином и между гуанином и цитозином. В результате таких взаимодействий ДНК существует в виде двунитевой структуры, о чем уже вкратце говорилось в § 1.3. Уотсон - Криков­ ские взаимодействия реализуются, если две полинуклеотидные цепи или два фрагмента одной цепи антипараллельны, причем рибозофосфатные остовы образуют правую спираль.

Рис. 28. Структура Уотсон - Криковских пар

Специфичность взаимодействия обеспечивается образованием водород­ ных связей. Между аденином и тимином или урацилом образуется две водо­ родные связи, между гуанином и цитозином - три. Важным свойством имен­ но этих пар гетероциклов и именно в приведенной их взаимной ориентации является близость размеров этих пар и их ориентации относительно связан­ ных с ними атомов С-Г, а тем самым и относительно всей периодической части остова. При такой геометрии цитозин не может образовать двух водо­ родных связей с аденином и также не могут взаимодействовать между собой два пиримидиновых гетероцикла. Не вписываются в такую геометрию и два взаимодействующих пуриновых гетероцикла. Взаимодействие гуанина с ура­ цилом и тимином возможно лишь с участием двух водородных связей и су­ щественно менее эффективно, чем взаимодействие гуанина с цитозином.

Последовательность чередования гетероциклов, т. е. последовательность нуклеотидов в одной из цепей или в одном из взаимодействующих фрагмен­ тов цепи, может быть произвольной. Вторая же комплементарная последова­

тарна структуре гибридизовавшегося олигонуклеотида, и следовательно од­ нозначно выводится из этой структуры.

На этом, в частности, был создан метод секвенирования, основанный на гибридизации исследуемой нуклеиновой кислоты с большим набором олиго­ нуклеотидов со всевозможными последовательностями нуклеотидов. Он бу­ дет рассматриваться в § 5.5.

Для большинства приложений методов, основанных на гибридизации с олигонуклеотидами, существенным фактором является прочность обра­ зующихся дуплексов, которую можно повысить при использовании цепей, построенных из нуклеотидов с соответствующим измененным рибозофосфатным остовом. Так, хорошие результаты получаются при использовании замкнутых нуклеотидов (§ 5.7). Знание первичной структуры ДНК позволяет рассчитать энергию образования определенного участка дуплексной струк­ туры. Однако этого нельзя сделать простым суммированием параметров, ха­ рактеризующих энергию взаимодействия пар нуклеотидов, поскольку такой расчет не учитывает энергию стекинг-взаимодействий. Более точным являет­ ся учет взаимодействия соседних пар нуклеотидов. Оценки соответствующих энергий делались рядом авторов, причем имеются определенные расхожде­ ния между полученными данными. Поэтому созданы соответствующие уни­ фицированные параметры, приводящиеся для всех мыслимых соседних пар. Эти параметры приведены в табл. 8.

Таблица 8 Унифицированные параметры для энергии взаимодействия между Уотсон —

Криковскими парами в составе полидезоксирибонуклеотидной цепи

Представленные данные относятся к системе, в которой речь идет о взаи­ модействии двух пар нуклеотидов, находящихся внутри двунитевой ДНК. Для полного расчета необходимо учесть, что крайние пары нуклеотидов, на­ пример, получающиеся при инициации образования двунитевой структуры,

не имеют с одной из сторон каких-либо соседних пар, и соответствующее значение AG° может иметь другое значение. Это существенно, если речь идет о расчете энергии для отдельного олигонуклеотида. В системе унифициро­ ванных параметров эти величины имеют значения для пары G C - 0,98, а для пары А Т - 1,03 ккал/моль.

Поскольку рассмотренные взаимодействия приводят к периодической структуре рибозофосфатного остова, то двуспиральные конформации рас­ сматриваются как элементы вторичной структуры нуклеиновых кислот.

Сказанное в первую очередь относится к двунитевой структуре ДНК. Од­ нако, как нетрудно видеть из приведенной структуры комплементарных пар, такие же взаимодействия могут иметь место и для полирибонуклеотидных последовательностей, поскольку ни появление 2’-ОН-группы, ни замена тимидина на уридин качественно не нарушают основные взаимодействия, ле­ жащие в основе образования комплементарных пар. То же самое можно ска­ зать и о смешанной двуспиральной структуре, состоящей из одной цепи ДНК и одной цепи РНК, которые образуются при инициации биосинтеза новых молекул ДНК и при синтезе ДНК на РНК-матрице, который имеет место при обратной транскрипции для первой стадии функционирования ретровирусов.

Хотя принцип образования двунитевых структур является общим, это не означает идентичность строения дуплексов ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНКРНК. Имеются четкие геометрические различия между этими дуплексами. Нуклеотидные пары не строго перпендикулярны осям спирали, их плоскости образуют некоторый угол с направлением оси. Ближе всего к перпендику­ лярному расположению относительно оси находятся пары гетероциклов

вструктуре, которую называют В-ДНК. Она представляет собой правую спи­ раль, на каждый шаг которой приходится одна пара комплементарных нук­ леотидов. Такая структура обладает винтовой осью, причем в биологических системах полный оборот спирали соответствует приблизительно 10,5 парам нуклеотидов. Расстояние между соседними парами вдоль оси составляет примерно 0,33 нм, а полный виток спирали соответственно имеет шаг 3,32 нм (рис. 30). Угол наклона плоскости, в которой располагается пара нуклеоти­ дов, по отношению к оси спирали близок к нулю (-1,2°). Для В-ДНК харак­ терно наличие 2’-эндо-конформации у фуранозного фрагмента.

Если представить себе цилиндр, опоясывающий В-ДНК, то видно, что

вего пределах остается достаточно свободного пространства. Это приводит

кобразованию вокруг двойной спирали двух бороздок. Они достаточно силь­ но различаются по своим размерам, и их называют соответственно большой и малой бороздками (см. рис. 30). При этом атомы гетероциклов, не участ­ вующие в Уотсон - Криковских взаимодействиях, оказываются экспониро­ ванными, что очень существенно для их реакционной способности и для спо­ собности к нековалентным взаимодействиям с белками и другими лигандами. Особенно существенна способность экспонированных атомов и групп к обра­ зованию водородных связей в качестве доноров или акцепторов протона.

Рис. 30. Фрагмент двойной спирали ДНК в В-форме

В большую бороздку экспонированы атомы N7 остатков гуанина и аденина, атомы Об остатков гуанина и атомы 04 остатков тимина (акцепторы прото­ на), экзоциклические аминогруппы остатков аденина 6-NH2и цитозина 4-NH2 (доноры протона). В малую бороздку экспонированы атомы N3 остатков гуа­ нина и аденина, атомы 0 2 остатков тимина и цитозина (акцепторы протона) и экзоциклическая аминогруппа гуанина (2- NH2, донор протона).

4.1.3. Искажения структуры дуплекса. Суперспирализация

В-ДНК с приведенными выше структурными параметрами является тер­ модинамически наиболее устойчивой, и ее рассматривают как релаксирован-